基于类碱性磷酸酶纳米酶的高灵敏分析方法研究

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纳米酶是指一类具有类酶催化活性的纳米材料。与天然酶和传统模拟酶相比,纳米酶具有稳定性高、催化活性可调节、功能可设计和裁剪、便于修饰等诸多独特的优点,使其具有很大的开发潜力。迄今为止,已发现许多具有类氧化还原酶活性的纳米酶,包括类过氧化物酶、类过氧化氢酶、类超氧化物歧化酶和类氧化酶等纳米酶,它们兼具酶学特性和纳米材料自身特性(如磁学、光学等),使得纳米酶在多种领域大放异彩,如生物传感、免疫检测、疾病诊疗和环境污染治理等领域。总而言之,这一类纳米酶的种类多且应用广泛。然而,类水解酶纳米酶的开发及应用还处于初步阶段。碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)是磷酸代谢中一种重要的水解酶,具有稳定性好、周转率高、分子尺寸小以及成本低等优势,不仅在细胞功能和发病机制中起重要作用,还在免疫分析中常被用作抗体的标记物,以实现检测信号的放大,从而显著降低检测限。然而,与类氧化还原酶纳米酶相比,已报道的具有类ALP催化活性的纳米酶种类屈指可数,仅有Ce O2、Zr O2、Zr或Ce基金属有机骨架(Metal-organic frameworks,MOFs)、Hf-Ni基MOFs及多肽纳米酶,而且基于类ALP纳米酶建立的分析方法也非常有限,大大地限制了类ALP纳米酶的分析应用。因此,基于类ALP催化活性的纳米酶,本论文提出了两种高灵敏的分析新方法,即化学发光免疫分析新方法和荧光分析新方法,分别应用于前列腺特异抗原(Prostate specific antigen,PSA)和阿仑膦酸钠(Alendronate sodium,ALDS)的检测。具体内容如下:(1)在论文第二章中,提出了一种基于类ALP纳米酶标和离子液体辅助的化学发光免疫分析新方法,并将其应用于PSA的高灵敏检测。首先,通过沉淀法制备了聚丙烯酸(Polyacrylic acid,PAA)修饰的Ce O2(PAA-Ce O2),并将其作为模型类ALP纳米酶。PAA-Ce O2可催化化学发光底物2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5-氯三环[3.3.1.13.7]癸烷])-4-基]-1-苯基磷酸二钠(CDP-Star)的去磷酸化,进而产生强的化学发光信号,这验证了PAA-Ce O2具有高类ALP催化活性。其次,引入16%(v/v)离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸酯([BMIM][BF4])时,PAA-Ce O2/CDP-Star体系的化学发光强度增加了近两倍。通过考察不同浓度乙醇对PAA-Ce O2/CDP-Star体系化学发光强度的影响,发现[BMIM][BF4]具有与有机溶剂相似的增强机理,即可提高CDP-Star的化学发光量子产率,进而导致化学发光强度的增加。最后,以PAA-Ce O2作为纳米酶标,CDP-Star为底物和PSA为模型分析物,建立了一种化学发光免疫分析新方法。其检测线性范围为1 pg/m L至1ng/m L,检测限为0.46 pg/m L。更重要的是,[BMIM][BF4]的添加可进一步将该方法的检测线性范围提高2个数量级和灵敏度提高10倍,使得检测限低至53 fg/m L。此外,该方法也具有良好的选择性和重现性,在疾病生物标志物的超灵敏定量检测中有着潜在的应用前景。(2)在论文第三章中,提出了一种基于类ALP纳米酶的荧光分析新方法,并将其应用于ALDS的高灵敏检测。首先,通过水热法制备了以L-天门冬氨酸(L-Aspartic acid,L-Asp)为配体的绿色Zr基MOFs MIP-202(Zr)。催化动力学研究发现,MIP-202(Zr)可催化荧光底物4-甲基伞形酮磷酸盐(4-Methylumbelliferone phosphate,4-MUP)生成具有蓝色荧光的产物4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone,4-MU),首次发现了MIP-202(Zr)具有较高的类ALP催化活性。其次,ALDS可降低MIP-202(Zr)/4-MUP体系的荧光强度,其机理在于ALDS可通过P-O键与MIP-202(Zr)的Zr-O簇形成强络合的Zr-O-P键,阻碍MIP-202(Zr)与其底物4-MUP的相互作用,进而抑制4-MUP的去磷酸化。最后,建立了一种基于MIP-202(Zr)/4-MUP体系的ALDS荧光传感方法,其检测线性范围为0.01-0.1μg/m L和0.1-3μg/m L,检测限低至2 ng/m L。此外,该方法也具有良好的选择性,可实现对尿液中ALDS的高灵敏检测,在临床药物分析中有着潜在的应用前景。
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