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生物质是一种替代化石资源的生产材料和能源。植物生物质的多样性及其结构的复杂性导致其降解面临巨大挑战，为了有效降解植物细胞壁，微生物进化了很多（酶）策略来实现该目标。该领域的一个重大突破是发现了一种多糖单加氧酶（Polysaccharide Monooxygenases，PMOs），它通过催化顽固多糖的氧化裂解，使经典的水解酶更加有效地降解生物质。 PMOs是一类铜离子依赖的酶，原来被归类为在真菌中反应迟缓的糖苷水解酶GH61家族或在细菌中起非催化功能的碳水化合物结合模块CBM33家族。2010年由于其被发现具有氧化裂解纤维素和几丁质的能力而被分别重新归类为辅助活性酶家族的AA9和AA10，并统称为裂解多糖单加氧酶或多糖单加氧酶。目前，PMOs被归类为碳水化合物活性酶CAZy数据库中的辅助活性酶类，它们形成AA9，AA10，AA11，AA13，AA14，AA15和AA16家族。 本研究以嗜热革节孢中的AA9家族（Auxiliary Activity family9）PMO酶为研究对象，从嗜热革节孢中克隆了AA9家族基因HiPMO1，并成功在毕赤酵母中异源表达，通过镍柱亲和层析获得HiPMO1纯酶。对该酶进行N端测序，确定了其N端第一个氨基酸为组氨酸，且该组氨酸没有甲基化修饰。利用薄层层析（TLC）、基质辅助激光解析电离飞行质谱（MALDI-TOF-MS）、高效液相离子色谱（HPAEC-PAD）、溴氧化、酶解法以及同源建模等方法，对HiPMO1酶氧化产物的组成及其功能进行了深入的研究。 HiPMO1酶在电子供体存在的情况下，分别与非可溶性底物磷酸膨胀纤维素（PASC）和可溶性底物木葡聚糖在pH5.0、50℃条件下反应48h后分析可溶性产物。TLC结果显示HiPMO1可以降解PASC和木葡聚糖，且降解木葡聚糖的能力显著低于降解PASC的能力。在氧化裂解PASC的过程中随着反应时间增加其氧化产物含量也逐渐增加，其产物主要由纤维二糖至纤维六糖组成。MALDI-TOF-MS分析显示，反应产物主要由非氧化型纤维寡糖和氧化型纤维寡糖组成，并且存在C1（m/z＋16）、C4或者C6（m/z-2）的氧化寡糖，此外还发现了可能存在C6位被氧化形成包含葡萄糖醛酸苷的纤维寡糖（m/z+12,+14,＋28）。为了区分C4或者C6氧化产物，对（m/z-2）峰值进行了MALDI-TOF-MS/MS分析，结果显示除了大量非氧化产物的碎片离子峰外，还存在C4或C6氧化产物的碎片离子峰，此外还存在仅可能在C6位氧化的碎片离子，说明在HiPMO1酶氧化产物中可能同时存在C4和C6氧化产物。 为了准确区分C4和C6氧化产物，将氧化产物用溴水进一步氧化后进行MALDI-TOF-MS分析，结果显示存在（m/z＋26）、（m/z＋28）、（m/z＋30）和（m/z＋44）的质谱峰，确定氧化产物中同时存在C4和C6氧化产物。综上所述，HiPMO1酶对底物PASC同时具有C1、C4和C6氧化的功能，且可能将C6位氧化形成包含葡萄糖醛酸苷的纤维寡糖。 HiPMO1酶氧化产物的MALDI-TOF-MS结果（m/z+12,+14,＋28）暗示可能存在C6位被氧化形成包含葡萄糖醛酸苷的纤维寡糖。为此运用了一种新的方法对可溶性氧化产物进行进一步分析，用β-葡萄糖醛酸苷酶和β-葡萄糖苷酶对可溶性氧化产物进一步酶解，对酶解产物进行LC-MS（全扫描和单离子检测）和HPAEC-PAD检测。 LC-MS结果显示有葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸（葡萄糖醛酸内酯）和葡萄糖二酸（葡萄糖二酸内酯）的质谱峰，并对其中的葡萄糖二酸内脂和葡萄糖醛酸的质谱峰进行了LC-MS/MS分析，进一步确定了葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的存在。HPAEC-PAD结果也显示存在葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸的离子色谱峰。LC-MS和HPAEC-PAD结果充分证明了HiPMO1酶将纤维素C6位氧化形成包含葡萄糖醛酸苷的纤维寡糖的事实。 为了评价HiPMO1酶不同氧化活性之间的差异，利用HPAEC-PAD对葡萄糖酸、葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸进行定量分析，结果显示物质的量从大到小依次为葡萄糖酸、葡萄糖二酸、葡萄糖醛酸，说明HiPMO1酶C1与C6氧化活性是不同的，且C1氧化活性大于C6氧化活性。由于没有C4氧化产物的标准品，故没有对C4氧化活性进行评价。 此外，对同样具有C6氧化功能的CtPMO1酶进行了平行实验。利用β-葡萄糖醛酸苷酶和β-葡萄糖苷酶对CtPMO1酶的氧化产物进一步酶解，对酶解产物进行LC-MS和HPAEC-PAD检测，结果与HiPMO1酶相似。 此外，对同样具有C6氧化功能的CtPMO1酶进行了平行实验。利用β-葡萄糖醛酸苷酶和β-葡萄糖苷酶对CtPMO1酶的氧化产物进一步酶解，对酶解产物进行LC-MS和HPAEC-PAD检测，结果与HiPMO1酶相似。 综上所述，嗜热真菌中AA9家族的PMOs具有C6氧化功能可能是普遍存在的，且具有C6氧化功能的PMO酶能够连续氧化纤维素中的C6位（-CH2OH→-CHO→-COOH）形成包含葡萄糖醛酸苷的纤维寡糖，然后通过β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶降解产生葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸和葡萄糖二酸，甚至可能通过β-消除裂解产生不饱和的纤维寡糖。该研究提供了一种通过氧化纤维素C6位来降解纤维素的新机制，并且提供了一种生产具有高附加值物质葡萄糖二酸的新途径。