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目的:研究细胞内蛋白酶体被抑制时,P38y/δ在泛素化蛋白aggresome形成过程中的功能。方法:①用蛋白酶体抑制剂MG132处理野生型AD293细胞,并用特异性识别磷酸化Thr180/Tyr182的P38抗体对该细胞进行Western检测,观察细胞内的蛋白酶体受抑制时,P38γ/δ的激活情况。②建立细胞株:采用CRISPR/Cas9技术在野生型AD293细胞中分别敲除p38γ、p38δ基因。用特异识别P38γ/δ的抗体进行Western检测,明确已成功建立p38y-/-、p38δ-/-细胞株;用Flag标签分别标记p38γ、p38δ,利用慢病毒表达系统在AD293 p38γ(KO)、AD293 p38δ(KO)细胞基础上建立稳定表达P38γ-Flag和P38δ-Flag的Rescue细胞株,分别用P38γ、P38δ特异性抗体进行Western检测,明确成功建立 AD293 p38y/δ(KO)-p38γ/δ-Flag Resuce 细胞株。③用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理 AD293 p38γ/δ(KO)和 AD293 p38y/δ(KO)-p38y/δ-Flag Resuce细胞株,用特异识别K48连接泛素链的抗体标记内源性泛素化蛋白,利用免疫荧光技术,在共聚焦显微镜下观察不同细胞株里aggresome的形成效率有无差别。④利用慢病毒表达系统,筛选并建立 AD293-SWP-p38γ(K56R)-Flag、AD293-SWP-p38δ(K54R)-Flag稳定细胞株,利用免疫沉淀富集P38γ/δ及其相互作用蛋白,SDS-PAGE分离、质谱鉴定得到一个与aggresome形成相关的P38δ下游底物分子-TPM1。⑤构建pcDNA3.1(+)-TPM1-3myc表达质粒。在AD293 p38y/δ(KO)细胞中瞬时表达TPM1,用特异识别K48连接泛素链的抗体标记内源性泛素化蛋白,利用免疫荧光技术,在共聚焦显微镜下观察用蛋白酶体抑制剂MG132处理后的aggresome形成情况。结果:①在蛋白酶体抑制剂MG132(2μM,16hr)处理条件下,P38γ/δ的磷酸化水平较未处理野生型细胞显著提高,P38γ/δ在细胞蛋白酶体受抑制的情况下被激活。②用特异性识别P38γ/δ的抗体分别检测野生型、p38γ(KO)、p38δ(KO)细胞株内源水平的P38γ/δ,Western结果显示利用CRISPR/Cas9技术成功获得了 AD293 p38γ/δ(KO)细胞株。③用分别敲除p38y/δ的细胞株在MG132(2μM,16hr)处理条件下,使用免疫荧光技术观察aggresome形成情况。与野生型AD293相比,p38γ-/-、p38δ-/-细胞株的aggresome形成效率明显下降。其中p38δ-/-细胞株的aggresome形成效率下降更显著。统计数据表明,以野生型AD293为参照,p38y-/-、p38δ-/-细胞株的aggresome形成效率分别不到10%、5%。在AD293细胞中敲除p38γ或p38δ可显著降低MG132处理时的aggresome形成效率。与野生型AD293相比,Resuce p38γ、p38δ细胞株的aggresome形成效率分别恢复到75%、88%。④利用AD293-SWP-p38γ(K56R)-Flag、AD293-SWP-p38δ(K54R)-Flag 稳定细胞株,通过免疫沉淀富集P38 γ/δ-Flag蛋白及其相互作用蛋白,SDS-PAGE分离,质谱分析得到TPM1等与p38γ/δ相互作用的蛋白。⑤在p38δ-/-细胞中过量表达TPM1,用MG132处理(2μM,16hr)可见泛素化蛋白能聚集形成分散的aggregate,但在p38γ-/-细胞中则没有这种效果。结论:①在MG132抑制蛋白酶体活力的条件下,P38γ、P38δ被激活。②p38γ、p38δ缺失导致细胞内aggresome形成障碍,但Rescue p38γ、p38δ的细胞可补救这种缺陷。③分离出P38δ的一个可能底物——TPM1。④在p38δ-/-细胞瞬时表达TPM1可补救该种细胞aggresome形成缺陷第一步,即形成 aggregate。