目的Ras及其下游的MAPK信号在肺癌中呈现高度活化状态,其活化的原因值得深入研究。DIAPH3（diaphanous related formin 3）在乳腺癌等多种肿瘤中呈现高表达趋势且促进肿瘤的多种恶性行为。但是,DIAPH3在肺癌进展中发挥的作用以及调控的下游信号转导事件仍不明确。本研究从DIAPH3在肺癌中表达水平的改变这一现象出发,利用细胞模型和动物模型探索DIAPH3在肺癌进展中的功能,阐明DIAPH3促进肺癌进展的分子机制。本研究将为肺癌的治疗提供新的靶点。方法1.利用GEPIA数据库分析DIAPH3在肺腺癌和肺鳞癌中的表达与病人生存之间的相关性。2.利用免疫组化染色和Western blot检测DIAPH3在肺腺癌组织和肺癌细胞中的表达水平。3.利用pLVX和pLKO.1慢病毒载体在肺腺癌细胞中过表达DIAPH3或干扰DIAPH3的表达,建立稳定表达细胞株。4.培养A549、SPC-A-1和KPC对照细胞和过表达DIAPH3的细胞,与MTT孵育4小时,加入DMSO溶解沉淀,测量540 nm处的吸光度,检测DIAPH3的表达上调对肺腺癌细胞生长的影响。5.培养A549、SPC-A-1、NCI-H358和KPC对照细胞和敲低DIAPH3表达的细胞,与MTT孵育4小时,加入DMSO溶解沉淀,测量540 nm处的吸光度,检测DIAPH3的表达下调对肺腺癌细胞生长的影响。6.培养A549、SPC-A-1和KPC对照细胞和过表达DIAPH3的细胞,进行软琼脂克隆集落实验。14天后拍照统计克隆的数目,检测DIAPH3的表达上调对肺腺癌细胞非锚定性生长的影响。7.培养A549、SPC-A-1和KPC对照细胞和敲减DIAPH3表达的细胞,进行软琼脂克隆集落实验。14天后拍照统计克隆的数目,检测DIAPH3的表达下调对肺腺癌细胞非锚定性生长的影响。8.在SPC-A-1细胞中干扰DIAPH3的表达,在A549细胞中过表达DIAPH3,然后分别进行裸鼠皮下成瘤实验,每周测量肿瘤体积,观察DIAPH3的表达对肺腺癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。9.利用pSECC载体构建慢病毒,通过鼻吸法在肺腺癌模型KP小鼠中敲减DIAPH3的表达。16周后,对小鼠肺组织进行HE染色,检测肿瘤个数,评估DIAPH3表达下调对原发肺腺癌的影响。10.利用银染和质谱联用鉴定DIAPH3相互作用的蛋白,并利用免疫共沉淀实验GST pull-down实验确定DIAPH3与STK38之间的相互作用。11.培养过表达DIAPH3和/或STK38过表达的肺腺癌细胞SPC-A-1,利用软琼脂集落实验检测抑制剂LY3214996对SPC-A-1细胞克隆集落的回复作用。结果1.通过使用生物信息学手段对GEPIA数据库中的数据进行提取和分析,我们发现DIAPH3在肺腺癌中的表达与病人的总生存时间负相关。DIAPH3表达水平越高,病人的生存时间越短。在鳞癌中,DIAPH3在肺鳞腺癌中的表达与病人的总生存时间没有显著相关性。2.在肺腺癌细胞A549、SPC-A-1和KPC中过表达DIAPH3促进细胞生长和在软琼脂上的克隆集落。在肺腺癌细胞A549、SPC-A-1和KPC中下调DIAPH3的表达抑制细胞生长和在软琼脂上的克隆集落,该过程可被RNA干扰抵抗的DIAPH3（rDIAPH3）所回复。3.在裸鼠皮下成瘤实验中,在SPC-A-1细胞中干扰DIAPH3的表达抑制肿瘤生长速度和实验终点时肿瘤大小。在A549细胞中过表达DIAPH3促进肿瘤生长速度和实验终点时肿瘤大小。4.在肺腺癌模型KP小鼠中敲减DIAPH3的表达以后,显著抑制肺腺癌原发小鼠模型的肿瘤个数。5.通过对DIAPH3相互结合的蛋白进行免疫共沉淀,银染确定差异表达蛋白,并切割有差异条带的胶条进行质谱鉴定,我们筛选到STK38是DIAPH3相互作用的蛋白,并通过免疫共沉淀实验和GST pull-down实验进一步验证了这一结果。6.在DIAPH3、STK38和MEKK相互作用的免疫共沉淀实验中,我们发现DIAPH3通过破坏STK38与MEKK之间的相互作用从而稳定MEKK的蛋白水平。结论1.DIAPH3在肺腺癌中表达上调,与病人生存显著负相关。2.DIAPH3在肺腺癌细胞中促进肿瘤细胞生长、克隆集落和裸鼠皮下成瘤。敲减DIAPH3抑制肺腺癌小鼠模型肿瘤发生。3.DIAPH3与STK38之间的互相作用破坏STK38与MEKK之间的结合,上调MEKK的蛋白水平。