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研究背景
宫颈癌是一种女性生殖系统肿瘤，为最常见的女性恶性肿瘤之一。近年来，其发病率与死亡率逐渐升高，严重威胁女性健康。现阶段关于宫颈癌发生发展机制尚未完全阐明，近年来研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在宫颈癌发生发展中关键作用，研究表明，lncRNA可作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，通过竞争性的结合微小RNA(microRNA， miRNA)以抑制其活性与功能，从而调控下游靶基因mRNA的表达，参与肿瘤发生进展。LncRNATDRG1是近年来新发现的对基因表达具有调控作用的长链非编码RNA，已有文献报道其在睾丸生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌等中与肿瘤恶性进展有相关性，可能为调控生殖系统肿瘤的关键因子，然而，TDRG1在宫颈癌进展中的调节机制尚不清楚，需要我们进一步探讨。
研究目的
本研究旨在探讨lncRNATDRG1对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。
第一部分TDRG1在宫颈癌组织中的表达差异及临床意义
研究方法
1.收集30例宫颈癌组织和30例正常宫颈组织，采用qRT-PCR检测TDRG1的表达水平；
2.分析TDRG1表达水平与宫颈癌患者临床病理特征、预后的关系；
3.通过生物信息学软件分析出TDRG1靶目标miR-326，qRT-PCR检测宫颈癌组织中miR-326的表达情况，Spearman相关性分析miR-326表达与TDRG1表达之间的相关性；
4.通过生物信息学软件分析出miR-326的下游靶标MAPK1，qRT-PCR检测宫颈癌组织中MAPK1mRNA的表达情况，Spearman相关性分析MAPK1表达与TDRG1、miR-326表达之间的相关性。
研究结果
1.宫颈癌组织中TDRG1表达水平高于正常宫颈组织；
2.TDRG1表达水平与宫颈癌患者FIGO分期(IIb-IIIa)、肿瘤分化(低)、宫颈浸润深度(≥2/3)和淋巴结转移(有)呈显著正相关；
3.宫颈癌患者中TDRG1高表达者总生存期平均值小于TDRG1低表达者；
4.qRT-PCR检测结果显示宫颈癌组织中miR-326表达水平低于正常宫颈组织，Spearman相关性分析显示TDRG1表达和miR-326表达呈负相关；
5.宫颈癌组织中MAPK1mRNA表达高于正常宫颈组织，Spearman相关性分析显示MAPK1表达与TDRG1表达呈正相关，与miR-326表达呈负相关。
研究结论
1.TDRG1在宫颈癌组织中呈高表达；
2.TDRG1的高表达增强宫颈癌侵袭力，与宫颈癌患者FIGO分期(Ⅱb-Ⅲa)、分化程度(低)、淋巴结转移(有)、宫颈浸润深度(≥2/3)以及预后不良呈正相关；
3.TDRG1表达和miR-326表达呈负相关；
4.TDRG1表达与MAPK1表达呈正相关，miR-326表达与MAPK1表达呈负相关。
第二部分TDRG1对宫颈癌细胞生物学行为的影响
研究方法
1.采用qRT-PCR检测人宫颈永生化鳞状细胞(Ect1/E6E7)和人宫颈癌细胞系(Hela，SIHA，CaSki)中TDRG1的表达水平，选取目标研究对象；
2.在Hela细胞中下调TDRG1表达，采用克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、transwell侵袭实验检测Hela细胞生物学行为变化。
研究结果
1.Hela，SIHA，CaSki细胞中TDRG1表达水平高于Ect1/E6E7，因Hela细胞TDRG1表达水平更高，选取其进行后续试验；
2.克隆形成实验结果显示下调TDRG1表达的细胞克隆数目减少；MTT实验结果显示下调TDRG1表达的细胞生长曲线降低；流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示下调TDRG1表达细胞凋亡增加；
3.细胞划痕实验结果显示下调TDRG1表达的细胞划痕愈合较慢；transwell侵袭实验结果显示下调TDRG1表达的细胞侵袭数量减少。
研究结论
1.TDRG1在人宫颈癌细胞系中呈高表达；
2.下调TDRG1表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。
第三部分TDRG1通过miR-326/MAPK1轴调控宫颈癌细胞增殖，迁移及侵袭
研究方法
1.采用双荧光素酶报告实验和RIP实验，验证TDRG1与miR-326的相互关系；
2.将Hela细胞与TDRG1siRNA和miR-326inhibitor共转染，采用克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、transwell侵袭实验研究其生物学行为的变化；
3.采用qRT-PCR和westernblot检测上调/下调TDRG1或miR-326对靶基因MAPK1的mRNA和蛋白表达水平变化。
研究结果
1.双荧光素酶报告实验显示miR-326可降低TDRG1的荧光素酶活性，RIP实验显示TDRG1可特异性富集miR-326；
2.与第二部分实验结果相比，克隆形成实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞克隆数目增加；MTT实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞在490nm处的吸光值升高；流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示下调TDRG1及miR-326表达细胞凋亡减少；
3.与第二部分实验结果相比，细胞划痕实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞划痕愈合距离增加；transwell侵袭实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞侵袭数量增加；
4.MAPK1mRNA及蛋白表达与miR-326表达与呈负相关；MAPK1mRNA及蛋白表达与TDRG1表达呈正相关。
研究结论
1.TDRG1可与miR-326特异性结合且二者表达水平呈负相关；
2.下调miR-326表达可部分逆转下调TDRG1表达对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用；
3.miR-326抑制MAPK1表达，TDRG1增强MAPK1表达；TDRG1可作为ceRNA竞争性吸附miR-326，抑制miR-326活性和功能，上调MAPK1表达水平；
4.TDRG1通过调控miR-326/MAPK1轴调节宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力以发挥其致癌性，促进宫颈癌发生发展；
5.TDRG1可以作为潜在靶标为宫颈癌的诊断、治疗和预后评价提供新思路和新方向。
宫颈癌是一种女性生殖系统肿瘤，为最常见的女性恶性肿瘤之一。近年来，其发病率与死亡率逐渐升高，严重威胁女性健康。现阶段关于宫颈癌发生发展机制尚未完全阐明，近年来研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在宫颈癌发生发展中关键作用，研究表明，lncRNA可作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，通过竞争性的结合微小RNA(microRNA， miRNA)以抑制其活性与功能，从而调控下游靶基因mRNA的表达，参与肿瘤发生进展。LncRNATDRG1是近年来新发现的对基因表达具有调控作用的长链非编码RNA，已有文献报道其在睾丸生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、卵巢癌等中与肿瘤恶性进展有相关性，可能为调控生殖系统肿瘤的关键因子，然而，TDRG1在宫颈癌进展中的调节机制尚不清楚，需要我们进一步探讨。
研究目的
本研究旨在探讨lncRNATDRG1对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。
第一部分TDRG1在宫颈癌组织中的表达差异及临床意义
研究方法
1.收集30例宫颈癌组织和30例正常宫颈组织，采用qRT-PCR检测TDRG1的表达水平；
2.分析TDRG1表达水平与宫颈癌患者临床病理特征、预后的关系；
3.通过生物信息学软件分析出TDRG1靶目标miR-326，qRT-PCR检测宫颈癌组织中miR-326的表达情况，Spearman相关性分析miR-326表达与TDRG1表达之间的相关性；
4.通过生物信息学软件分析出miR-326的下游靶标MAPK1，qRT-PCR检测宫颈癌组织中MAPK1mRNA的表达情况，Spearman相关性分析MAPK1表达与TDRG1、miR-326表达之间的相关性。
研究结果
1.宫颈癌组织中TDRG1表达水平高于正常宫颈组织；
2.TDRG1表达水平与宫颈癌患者FIGO分期(IIb-IIIa)、肿瘤分化(低)、宫颈浸润深度(≥2/3)和淋巴结转移(有)呈显著正相关；
3.宫颈癌患者中TDRG1高表达者总生存期平均值小于TDRG1低表达者；
4.qRT-PCR检测结果显示宫颈癌组织中miR-326表达水平低于正常宫颈组织，Spearman相关性分析显示TDRG1表达和miR-326表达呈负相关；
5.宫颈癌组织中MAPK1mRNA表达高于正常宫颈组织，Spearman相关性分析显示MAPK1表达与TDRG1表达呈正相关，与miR-326表达呈负相关。
研究结论
1.TDRG1在宫颈癌组织中呈高表达；
2.TDRG1的高表达增强宫颈癌侵袭力，与宫颈癌患者FIGO分期(Ⅱb-Ⅲa)、分化程度(低)、淋巴结转移(有)、宫颈浸润深度(≥2/3)以及预后不良呈正相关；
3.TDRG1表达和miR-326表达呈负相关；
4.TDRG1表达与MAPK1表达呈正相关，miR-326表达与MAPK1表达呈负相关。
第二部分TDRG1对宫颈癌细胞生物学行为的影响
研究方法
1.采用qRT-PCR检测人宫颈永生化鳞状细胞(Ect1/E6E7)和人宫颈癌细胞系(Hela，SIHA，CaSki)中TDRG1的表达水平，选取目标研究对象；
2.在Hela细胞中下调TDRG1表达，采用克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、transwell侵袭实验检测Hela细胞生物学行为变化。
研究结果
1.Hela，SIHA，CaSki细胞中TDRG1表达水平高于Ect1/E6E7，因Hela细胞TDRG1表达水平更高，选取其进行后续试验；
2.克隆形成实验结果显示下调TDRG1表达的细胞克隆数目减少；MTT实验结果显示下调TDRG1表达的细胞生长曲线降低；流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示下调TDRG1表达细胞凋亡增加；
3.细胞划痕实验结果显示下调TDRG1表达的细胞划痕愈合较慢；transwell侵袭实验结果显示下调TDRG1表达的细胞侵袭数量减少。
研究结论
1.TDRG1在人宫颈癌细胞系中呈高表达；
2.下调TDRG1表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。
第三部分TDRG1通过miR-326/MAPK1轴调控宫颈癌细胞增殖，迁移及侵袭
研究方法
1.采用双荧光素酶报告实验和RIP实验，验证TDRG1与miR-326的相互关系；
2.将Hela细胞与TDRG1siRNA和miR-326inhibitor共转染，采用克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术、细胞划痕实验、transwell侵袭实验研究其生物学行为的变化；
3.采用qRT-PCR和westernblot检测上调/下调TDRG1或miR-326对靶基因MAPK1的mRNA和蛋白表达水平变化。
研究结果
1.双荧光素酶报告实验显示miR-326可降低TDRG1的荧光素酶活性，RIP实验显示TDRG1可特异性富集miR-326；
2.与第二部分实验结果相比，克隆形成实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞克隆数目增加；MTT实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞在490nm处的吸光值升高；流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示下调TDRG1及miR-326表达细胞凋亡减少；
3.与第二部分实验结果相比，细胞划痕实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞划痕愈合距离增加；transwell侵袭实验结果显示下调TDRG1及miR-326表达的细胞侵袭数量增加；
4.MAPK1mRNA及蛋白表达与miR-326表达与呈负相关；MAPK1mRNA及蛋白表达与TDRG1表达呈正相关。
研究结论
1.TDRG1可与miR-326特异性结合且二者表达水平呈负相关；
2.下调miR-326表达可部分逆转下调TDRG1表达对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用；
3.miR-326抑制MAPK1表达，TDRG1增强MAPK1表达；TDRG1可作为ceRNA竞争性吸附miR-326，抑制miR-326活性和功能，上调MAPK1表达水平；
4.TDRG1通过调控miR-326/MAPK1轴调节宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力以发挥其致癌性，促进宫颈癌发生发展；
5.TDRG1可以作为潜在靶标为宫颈癌的诊断、治疗和预后评价提供新思路和新方向。