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研究背景通过该研究项目,利用PCR方法对14种引起食源性疾病(食物中毒)的致病微生物进行检测并获得其最佳PCR反应条件,根据每种食源性致病微生物PCR检测基因的引物的退火温度的高低以及扩增产物片段的大小将其分组进行PCR反应条件的优化实验,使多个测试项目在同一批次进行PCR检测,从而大大缩减了检测时间,给现场疫情处理赢得时间。最终,建立一个快速、简便、准确、敏感、特异、有效的微生物检测平台,为突发事件现场调查处理及患者的治疗提供及时准确的信息和依据。研究方法从文献中查找部分食源性致病菌的PCR扩增引物序列,同时,在GenBank数据库中查找部分食物性致病菌的特异性基因序列,再依据特异性的靶序列使用Primer5.0软件进行引物设计。依据退火温度和扩增片段的大小对14种食物中毒致病菌进行分组,然后,对多重PCR和多项目同批次PCR的反应条件进行优化实验。研究结果本文利用多重PCR和多项目同批次PCR技术对14种食物中毒致病菌进行了检测方法的研究,取得了以下成果：1.依据退火温度与产物片段大小将14种致病菌分成三组,使它们能够通过多项目同批次PCR一次性检测出来。分组方案如下,第一方案：(1)沙门氏菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌、奇异变形杆菌、空肠弯曲菌,(2)志贺氏菌、肠出血性大肠埃希菌0157、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、创伤弧菌、产气荚膜梭菌,(3)蜡样芽胞杆菌、溶血性链球菌、小肠结肠耶尔森菌；第二方案：(1)沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、空肠弯曲菌, (2)肠出血性大肠埃希菌0157、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌、阪崎肠杆菌、奇异变形杆菌,(3)单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌、溶血性链球菌、小肠结肠耶尔森菌。2.优化了多项目同批次PCR反应体系的退火温度、引物用量、灵敏度以及引物比例。多项目同批次PCR反应体系的最佳退火温度为52℃；最佳混合引物用量为0.6-0.8μL；基因组DNA检测灵敏度可达到8×10-4ng/μL；第一方案致病菌的最佳引物比例分别为1：1：3：3：2,1：1：1：1：3：3,1：1：2；第二方案致病菌的最佳引物比例分别为1：1：1：3：2,1：1：3：3：2,1：1：1：2。3.利用多项目同批次PCR反应体系的条件成功从3位食物中毒患者的呕吐物、腹泻物以及吃过的可疑食品样品中检出副溶血性弧菌。4.将常规PCR与多重PCR的灵敏度和在食物中毒样品检测中的应用效果进行了比较。常规PCR的基因组DNA检测灵敏度可达到2×10-7ng/μL,而多重PCR的基因组DNA检测灵敏度只有2×10-6ng/μL；常规PCR比多重PCR更容易从食物中毒样品中检测出致病菌。研究结论本文利用多项目同批次PCR技术可以将14种食物中毒致病菌同时完成检测,建立了一个快速、简便、准确、敏感、特异、有效的微生物检测平台,从而为突发事件现场调查处理及患者的治疗提供及时准确的信息和依据。