食管癌是来源于黏膜上皮和粘膜腺体的常见恶性肿瘤,中国是食管癌发病率、死亡率最高的国家之一。2014年我国食管癌的发病率为18.85/10万,死亡率为14.11/10万。多数患者确诊时即为中晚期,放疗是中晚期食管癌主要的治疗方式之一,在改善梗阻、疼痛等症状和提高患者生活质量方面有明显优势,然而复发转移仍是死亡的主要原因。随着放射治疗设备和放疗技术持续发展,以及三维适形调强放疗、螺旋断层放疗等新技术在食管癌治疗领域的应用,提高了靶区适形性和剂量均匀性,降低了放射性肺炎、放射性心肌损伤等毒副反应的发生率,但是中晚期食管癌总生存没有明显改善,5年生存率仅为10%。长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸(nucleotide,nt)、不编码蛋白质的RNA分子。lncRNA起初被认为没有生物学功能,是基因组转录的“背景噪音”。近年来的研究表明,lncRNA在核内、核外,可通过染色质修饰、转录及转录后调控、分子海绵等机制参与细胞的发育、分化、生长及凋亡的生物学过程。全基因组研究显示,lncRNA通过与DNA、RNA、蛋白质等生物大分子相互作用调控细胞的恶性转化。在肺癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌和肾癌等肿瘤中,lncRNA表达水平异常与不良预后相关。靶向抑制lncRNA与大分子的相互作用,干扰或修饰基因的表达,为肿瘤治疗提供了新的策略。总之,lncRNA是肿瘤的重要调控因子,也是潜在的治疗靶点。食管癌和正常的癌旁组织存在大量差异表达的lncRNA,RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)的基因表达谱分析表明,食管癌有127个lncRNA的差异表达是正常组织的4倍以上,提示lncRNA异常表达可能与食管癌恶性表型密切相关。血液中的POU3F3、Linc00152等长链非编码RNA可以用于食管癌的早期诊断,而MALAT1的高表达与食管癌不良预后密切相关。进一步的研究显示,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录和转录后调控、单核苷酸多态性等多种机制促进食管癌增殖、分化和侵袭。但是,与食管癌相关的lncRNA研究相对较少,其功能和作用机制有待于进一步阐明。放疗是食管癌的重要治疗手段,放疗敏感性的个体差异较大,部分患者表现为放疗抵抗,因此明确放疗敏感性的分子机制,识别新的分子靶点,对改善食管癌放疗疗效有重要作用。例如,细胞因子信号传导抑制蛋白1(suppressorof cytokine signaling,SOCS1)可以抑制STAT3-Mcl-1信号通路,从而诱导细胞凋亡和增强放疗后DNA损伤,提高食管癌放射敏感性,为新的食管癌治疗策略提供基础。高通量的测序或者芯片技术将研究对象从单个基因提高到全基因组水平。有研究者通过文献获得不同肿瘤的基因表达谱,建立放疗预测模型来评价肿瘤细胞系的固有敏感性。该模型成功地预测了 22个肿瘤细胞系2Gy照射后的生存分数(survival fraction at 2 Gy,SF2),并确定3个与放疗敏感性相关的新基因(RbAp48、RGS19、R5PIA),进一步的研究显示RbAp48过表达的细胞处于G2/M期的比例更多,RbAp48通过拮抗Ras通路,诱导放疗增敏。高通量的测序或者芯片技术,已经成为研究放疗抵抗或者肿瘤发生发展相关分子机制的有力工具。本研究基于食管癌细胞系转录组高通量测序的数据分析,经实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative,RT-PCR)验证,发现放疗前后差异表达的未知的lncRNAECIR-1,研究ECIR-1对食管癌生物学行为的影响和作用机制。一、食管癌放疗前后差异表达的lncRNA的筛选放疗后细胞在基因水平发生复杂的反应,不同细胞系放疗敏感性存在异质性,很多因素会影响放疗后分子水平的变化,例如:放疗剂量、剂量率和检测时间等。放疗剂量、剂量率和基因水平之间可能存在剂量效应关系,不同的检测时间可能对应不同的基因表达谱,所以研究放疗前后差异表达的非编码基因,首先需要确定放疗剂量和检测的时间点。选择半数抑制浓度(50%concentration ofinhibition,IC50)作为放疗剂量参考,将放疗后24小时内DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DNADSB)的最高峰作为提取细胞RNA的时间点。首先用CCK-8检测不同剂量放疗后第七天,食管癌细胞EC-109、TE-1和KYSE150的抑制率,计算IC50;然后,用IC50剂量进行照射(剂量率2Gy/分钟),在食管癌细胞放疗后0、0.25、0.5、1、3、5、8、12、24小时9个时间点,采用Western blot检测γH2AX蛋白表达水平变化,γH2AX是DNA DSB的分子标志物,γH2AX的表达量反映了放疗后DNA DSB效应。结果显示,食管癌细胞EC-109、TE-1、KYSE150 放疗后第七天的 IC50 值分别为 5.7Gy、3.7Gy、4.3Gy,三个细胞系的yH2AX蛋白表达水平均在放疗后1h达到最高点。食管癌细胞EC-109、TE-1分别以5.7Gy和3.7Gy照射后1h,用Trizol法提取细胞总RNA,未行放疗的EC-109、TE-1的总RNA作为阴性对照,送检RNA-Seq,分析放疗前后差异表达的非编码基因。对两个细胞系中共同上调或者共同下调且差异倍数大于2的非编码基因取交集,用RT-PCR验证RNA-Seq的结果。RNA-Seq数据分析发现,放疗后EC-109、TE-1有121个共同下调的基因,差异倍数大于2的基因有13个;有129个共同上调的基因,差异倍数大于2的基因有12个。将上述25个基因全部作为候选基因进行RT-PCR检测,验证的结果表明,放疗后两个细胞系共同上调的非编码基因有4个,共同下调的有4个,选择稳定下调lncRNAECIR-1作进一步研究。综上所述,放疗后食管癌中的lncRNA表达水平发生变化,通过RNA-Seq和RT-PCR筛选出未知的lncRNA ECIR-1,进一步验证ECIR-1对食管癌的恶性表型是否有影响。二、lncRNA 在食管癌发生发展中的作用及机制为检测lncRNA 是否影响食管癌细胞的发生发展,采用小干扰RNA(small-interfering RNA,siRNA)无义序列和ECIR-1的 siRNA(97#,195#,351#)分别转染食管癌EC-109、TE-1细胞,干扰目的基因表达,RT-PCR检测目的基因ECIR-1敲低的情况;用pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1 转染食管癌EC-109、TE-1细胞,过表达ECIR-1,RT-PCR验证过表达效率。将ECIR-1干扰或过表达后,用细胞计数法检测EC-109、TE-1细胞转染后24h、48h、72h细胞增殖的变化;运用平板克隆形成实验,验证细胞克隆形成能力;用划痕实验检测ECIR-1与食管癌细胞迁移的关系;碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)染色后用流式细胞仪检测细胞周期,Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果显示,干扰EC-109、TE-1中ECIR-1的表达,食管癌细胞增殖能力下降,克隆形成能力降低,迁移能力降低,细胞凋亡增加;与此相反,上调ECIR-1的表达,食管癌细胞增殖能力增加,克隆形成能力增加,细胞凋亡减少。不管是敲低还是过表达,细胞周期的分布都没有明显变化。以上研究表明,lncRNAECIR-1与食管癌细胞EC-109和TE-1的恶性增殖、克隆形成、迁移和凋亡的过程密切相关。LncRNA ECIR-1是反义lncRNA,研究表明,反义lncRNA有高度的位点特异效应,可以同正义链邻近基因的信使RNA(messenger RNA,mRNA)形成RNA-RNA二聚体,提高邻近基因mRNA的稳定性,进而上调邻近基因表达。ECIR-1的邻近基因是白介素6信号传导子(interleukin6 signal transducer,IL-6ST),IL-6ST编码的蛋白gp130是白介素6受体(interleukin6 receptor,IL-6R)的信号传导链,IL-6只有和受体形成IL-6/IL-6R/gp130复合体才能发挥生物学功能,并由gp130进一步激活下游通路,所以gp130对于IL-6信号的传导起到关键作用。为明确ECIR-1是否能够影响IL-6ST的表达,将EC-109细胞的ECIR-1干扰或过表达后,用RT-PCR和Western blot检测IL-6ST的mRNA和蛋白表达水平的变化。干扰EC-109细胞中ECIR-1的表达后,IL-6ST的mRNA和蛋白水平随之降低;而过表达ECIR-1,IL-6ST的蛋白水平增加,但是mRNA没有明显变化。为明确ECIR-1是否进一步激活gp130(IL-6ST编码的蛋白)的下游信号通路,首先用Western Blot检测下游的磷酸化Janus激酶(phosphorylated Janus kinase,pJAK)水平,结果显示pJAK在食管癌细胞EC109中本底表达量很低,即使在培养基中加入IL-6共培养,也没有激活pJAK的表达,这表明ECIR-1对食管癌表型的影响可能与JAK通路无关。进一步研究发现,ECIR-1与磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal regulated kinases,pERK)的表达量呈正相关。敲低ECIR-1,gp130下游的pERK减少;而过表达ECIR-1,下游的pERK随之增加。与此同时,无论是敲低还是过表达ECIR-1,总ERK水平不变。以上结果证实lncRNA 可能通过ERK/促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)影响下游通路激活,促进食管癌发生发展。综上所述,lncRNA ECIR-1在转录和转录后水平调节IL-6ST的表达,并部分通过激活ERK/MAPK,影响食管癌细胞的增殖和迁移,调控肿瘤细胞的恶性表型。三、LncRNA ECIR-1在食管癌中的表达以及与放疗敏感性的关系为明确lncRNAECIR-1在组织中的表达,搜集了 20例食管鳞癌患者的癌和癌旁组织进行RT-PCR检测,结果显示食管癌组织中,ECIR-1的表达高于癌旁组织。为明确ECIR-1对食管癌细胞放疗敏感性的影响,首先采用小干扰RNA无义序列和siRNA(97#,195#,351#)转染食管癌EC-109细胞,干扰目的基因表达,用平板克隆形成实验和MTT实验,分别验证放疗后细胞克隆形成能力和增殖能力的变化。结果显示,随着放疗剂量的增加,细胞的克隆形成能力和增殖能力逐步下降,ECIR-1和放疗表现出明显的协同作用。为进一步验证ECIIR-1对食管癌患者放疗客观缓解率(objective response rate,ORR)的影响,用免疫组化检测53例患者病理蜡块中gp130的表达,回顾性分析了患者放疗效应和gp130表达的相关性,间接反映ECIR-1与食管癌放疗的关系。结果显示,低表达gp130的患者ORR优于高表达的患者。无进展生存(progression-free survival,PFS)的单因素分析显示,影响预后的因素有ORR和放疗剂量,而多因素分析显示,ORR是PFS唯一的预后因素。综上所述,lncRNA ECIR-1在食管癌中呈高表达,与放疗有明显的协同作用,gp130低表达的食管癌患者放疗后的ORR更高。本研究首次对食管癌放疗前后差异表达的基因进行测序,以识别与肿瘤发生或预后相关的基因或者核心通路。筛选出放疗后稳定下调的新的长链非编码RNA ECIR-I,证实ECIR-1对食管癌生物学行为的影响,初步探讨了其对食管癌表型的影响和作用机制。检测了ECIR-1在癌和癌旁组织的表达差异,验证了敲低ECIR-1对食管癌细胞放疗敏感性的影响,以及IL-6ST编码的gp130和患者放疗敏感性的相关性,为了解食管癌的发病机制和潜在治疗靶标提供了实验基础。