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β-乳球蛋白是反刍动物乳清蛋白中含量最高的组分,目前已有多种外源蛋白通过β-乳球蛋白基因调控序列指导在乳腺中实现了特异性高效表达,同时它也是一种主要致敏原。锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease, ZFN)技术是一种高效、特异、适用性广泛的基因组靶向修饰技术,目前已成功应用于多种细胞和生物的基因敲除和定点重组。运用ZFN敲除β-乳球蛋白基因、同时将外源基因同源重组到β-乳球蛋白基因调控序列下游,理论上不仅可以消除羊乳的过敏原,还可以实现外源基因的高效表达。要达到这一目标,高效、特异的ZFN的设计与筛选是关键步骤,而灵敏、稳定的筛选体系十分重要。本研究构建了以红色荧光蛋白为标记基因的ZFN通用表达载体,并以β-乳球蛋白为靶基因设计、构建了6对ZFN,对ZFN的不同筛选方法进行探索。发现荧光标记ZFN筛选体系稳定、灵敏度高,可作为ZFN的真核筛选体系,ZFNpRVNFw-728可以有效切割靶基因序列,为实现β-乳球蛋白基因的高效敲除和外源基因在此位点的高效定点整合奠定了基础。具体内容如下：第一、ZFN通用表达载体的构建构建了真核表达载体N13AX·pTARGET和PsvRed·CMV。载体NI3AX·pTARGET以SV40启动子下的绿色荧光蛋白基因和Neo基因作为标记基因,载体PsvRed·CMV以SV40启动子下的红色荧光蛋白基因作为标记基因,两载体均可通过CMV启动子用于真核表达。转染两个载体至奶山羊胎儿成纤维细胞可观察到标记基因的正常表达,表明载体构建成功。在真核表达载体PsvRed·CMV的CMV启动子下游插入NLS和Fokl构建了含野生型Fokl的ZFN通用表达载体PRVNF和含优化后密码子Fokl的ZFN通用表达载体PRVNFw,为锌指核酸酶的构建和表达奠定了基础。第二、以山羊β-乳球蛋白为靶基因的ZFN载体构建与表达以山羊β-乳球蛋白为靶基因设计三对锌指蛋白并合成其DNA序列,将其插入本试验构建的两个ZFN通用表达载体PRVNF和PRVNFw中构建六对ZFN。将构建好的ZFN转入奶山羊胎儿成纤维细胞后在mRNA水平上检测到ZFN的表达。第三、ZFN筛选体系的探索本试验对三种ZFN筛选体系进行探索。①对荧光标记ZFN筛选体系进行了探索。将ZFN靶序列插入到pEGFP-N1载体绿色荧光蛋白基因序列(去除起始密码子)5’端,构建三个荧光标记的ZFN筛选载体,转染该载体至Hela细胞中不能发出绿色荧光,用G418筛选两周后转入ZFN,有效的ZFN可使细胞产生DSB, NHEJ途径修复DSB会使细胞有1/3的概率发出绿色荧光。将本试验构建的六对ZFN转入含相应靶序列的Hela细胞中,pRVNFw-728组可观察到绿色荧光,表明pRVNFw-728可以切割靶序列,更重要的是,证明该方法灵敏度较高,可用于ZFN的真核筛选。为了进一步提高检测的灵敏度,本试验构建了双荧光标记载体BLG-REG,该载体先将BLG编码区与红色荧光蛋白序列(含终止子)同框融合,再融合到pEGFP-N1载体绿色荧光蛋白序列(去除起始密码子)5’端,且使两个荧光标记基因处于不同ORF中。该载体转染至胎儿成纤维细胞中能发出红色荧光而不能发出绿色荧光,将有效的ZFN转染至含该载体的细胞株中,非同源末端连接途径修复DSB可使细胞有1/3的概率发出绿色荧光而不发出红色荧光,1/3的概率既不发出绿色荧光也不发出红色荧光。②对酵母单杂交方法用于ZFN筛选进行了探索。构建了3个酵母单杂交Bait载体和6个酵母单杂交表达载体,同时对双载体转化酵母菌条件进行了优化,在每种质粒用量200ng、10μL Carrier DNA、100μL感受态细胞和70μL DMSO条件下转染效率最高,达到6500cfu/μg DNA,为本试验后续进行酵母单杂交验证ZFN作用效果打下基础。③对PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳法用于ZFN筛选进行了探索。根据NHEJ途径修复DSB会造成碱基数变化的原理在ZFN靶位点上下游各100bp处设计引物,以转染ZFN96h的细胞DNA做模板,PCR扩增产物20%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。发现该方法灵敏度较低,不适合检测ZFN在成纤维细胞中的效果。