双酚A(BPA)是一种重要的化工原料,广泛用于食品与饮料的包装、婴儿奶瓶、塑料水杯、眼镜等各种日常用品的制造过程中。由于具有和内源性雌激素(E2)类似的结构,BPA可以模拟E2的功能,干扰机体的正常生殖发育。研究表明生殖相关激素合成紊乱、精巢的发育异常以及精子的质量下降等均与BPA的暴露存在一定关系,但其具体的分子机制尚不十分明确。本研究以稀有鮈鲫为研究模型,通过高通量测序,在转录组水平上研究不同浓度BPA对精巢基因表达的影响,并以转录组数据为基础,在性激素合成、生殖细胞发育、精子形态功能以及生物标志物四个方面进行后续深入研究,主要研究进展如下:1.转录组结果表明暴露1周后,1,15和225μg/L BPA均可影响精巢的性激素合成、血睾屏障、蛋白质水解、脂质转运和代谢、细胞周期以及细胞凋亡相关基因的表达;1μg/L BPA主要影响肾素血管紧张素系统通路相关基因,并且可能激活mER通路;1和15μg/L BPA主要抑制tRNA加工相关基因的表达;15和225μg/LBPA主要抑制止血和血液凝固相关基因的表达。2.在转录组数据中发现性激素水平以及其合成相关基因的表达在BPA处理下显著变化。为探究其分子机制,我们克隆分析了性激素合成相关酶类(star、hsd3b、hsd11b2、cyp11a、cyp17a1及cyp19a1a)启动子,结果发现性激素合成相关基因启动子区存在性激素受体(Esrs及Ar)及转录因子(Nr5as及Foxl2)的潜在作用元件。并发现在5,15和50μg/L BPA作用2周和5周后,star与esr1,hsd3b与nr5a1a/hsd11b2/nr5a1a/esr2b,cyp11a与nr5a1a/nr5a1b,cyp17a与esr2b/ar,cyp19a1a与foxl2/esrs的m RNA表达变化之间均存在显著相关关系。证实BPA对稀有鮈鲫性激素合成的影响可能包含改变性激素合成途径中的esrs/ar,以及改变转录因子nr5a1/foxl2的表达这两个途径。3.在鱼类上未有BPA诱导生殖细胞凋亡的报道,但转录组结果显示225μg/L BPA对精巢凋亡相关基因表达有显著影响。在225μg/L BPA处理雄鱼1、3和9周后,通过TUNEL染色以及超微结构观察发现BPA可以诱导精母细胞凋亡,并且随暴露时间的延长而加剧。WB检测发现在精巢抗凋亡蛋白Bcl2与促凋亡蛋白Bax比值的下降是BPA诱导精母细胞凋亡的主要原因;由bcl2、bax、casp9、cytc以及mcl1参与的内源的线粒体途径在在一过程有重要作用;与此同时,细胞分裂相关基因kpna7、wee2以及既参与细胞分裂又参与细胞凋亡的基因birc5、ccna1、gasa1a也都受到BPA影响,推测BPA所诱导的精母细胞凋亡与细胞周期阻滞可能存在一定关系。4.通过超微结构观察发现15和225μg/L BPA的暴露影响了稀有鮈鲫精子细胞质收缩以及细胞膜完整性;同时精子的运动时间受到影响,受精能力也被减弱,并且这些影响随着BPA暴露时间的延长、浓度增加(1、2和3周)而加剧,但是其机制并不明确。而转录组数据显示在BPA处理下,参与精子形变、运动以及渗透压调节的aqps基因表达被显著诱导。我们通过渗透压耐受性实验证实BPA暴露后的雄鱼排出精子的低渗透耐受力下降,提示aqps确实参与了BPA所诱导的精子形态异常及功能减弱。随后的IHC和WB结果表明Aqp3及8蛋白广泛分布在各阶段的生殖细胞中,并且在BPA的处理下,Aqp3及8的表达量显著升高,这可能是精子形态及功能发生改变的主要原因。最后ChIP试验证实BPA可以通过提高Esr在aqp3及8启动子区的募集来诱导其表达。5.转录组数据显示肝脏特异性环境雌激素标志物vtg在稀有鮈鲫的精巢中表达,其表达量随BPA浓度增加显著性下降。IHC结果发现Vtg蛋白存储于精原细胞及精母细胞细胞质中,暗示Vtg在精子发生过程中可能发挥重要作用。后续ChIP和CoIP试验证实BPA会抑制精巢Esr-Hsp90复合体的解离,减少了游离的Esr,从而减弱vtg的转录激活,抑制其在精巢合成。但肝脏中BPA诱导的Vtg可能补充到精巢,在长时间暴露后精巢Vtg蛋白水平有所恢复。精巢vtg1与vtg2基因的转录在BPA的处理下呈时间依赖性下降。因此在BPA处理下,精巢vtg基因有作为精巢组织特异性的生物标志物的潜力。综上所述,本研究证实BPA对稀有鮈鲫精巢影响是多方面的,BPA可以通过影响精巢性激素受体基因及转录因子的表达来影响性激素合成酶类的表达,进而影响精巢性激素合成;通过内源性线粒体途径诱导精母细胞凋亡,并与精母细胞减数分裂受阻有一定关系;通过诱导Aqps的表达影响精子形态异常和运动、降低其渗透压耐受性,从而降低其受精能力。此外,BPA可以降低精巢内源性Vtgs的合成,精巢vtgs基因有潜力作为精巢对BPA预警的特异性生物标志物。