论文部分内容阅读
本文主要分为以下几个部分: 第一部分:急性移植物抗宿主病小鼠模型的建立 目的:构建急性移植物抗宿主病（acute Graft-Versus-Host-Disease，aGVHD）小鼠模型并评价过继性输注雷帕霉素（rapamycin，RAPA）体外诱导的耐受性树突状细胞(dendritic cells，DCs)治疗aGVHD的效果。 方法:以BALB/C(H-2Kd)为供体，C57BL/6J(H-2Kb)为受体建立aGVHD小鼠模型(BALB/C→C57BL/6J);以小鼠来源的骨髓细胞经体外培养获得DCs，加入RAPA诱导其为耐受性DCs(RAPA-tDCs);将RAPA-tDCs经尾静脉过继性输注至aGVHD模型小鼠，建立活体荧光成像可观察的DCs体内示踪模型并被研究萤火虫荧光素酶报告基因标记的DCs在aGVHD小鼠体内的迁移、归巢模式;记录各组小鼠的平均体重波动并统计其生存率状况，评价RAPA-tDCs抑制小鼠aGVHD的效果。 结果:与PBS对照组比较，RAPA能明显抑制DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHCII表达水平，且使表达DCs表面趋化因子受体CCR1（14.5±1.4 vs.10.0±2.1）、CCR5（12.7±2.3 vs.7.2±1.2）表达下调，而对CCR7（7.8±1.3 vs.6.2±2.5）的表达没有显著影响。成像结果显示，RAPA处理对DCs在体迁移能力无显著影响，RAPA-tDCs仍然具有归巢至淋巴结、脾脏等淋巴组织或器官的能力。最后，与PBS-DCs对照组比较，实验组aGVHD小鼠体重下降趋势明显放缓(-2.4±1.5 vs.-1.9±1.2，P＜0.05)，且其生存期延长（10.1±5.5 vs.16.6±6.7，P＜0.05），但整体存活率无显著性差异。 结论:aGVHD小鼠模型构建成功。RAPA能通过抑制DCs表面共刺激分子的表达从而诱导DCs耐受，过继性输注的RAPA-tDCs仍具有一定的T细胞富集区归巢能力且能够一定程度缓解aGVHD，延长小鼠的生存期，但没有改善其整体存活率。 第二部分:氧化石墨烯对树突状细胞在体迁移归巢能力的影响及其机制研究 目的:通过研究纳米材料氧化石墨烯(graphene oxide，GO)对小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cells，imDCs)共刺激分子、趋化因子受体表达水平及炎症应答能力，探讨GO对imDCs在体迁移及归巢能力的影响并研究其机制，为设计和应用氧化石墨烯-神经肽复合物诱导耐受性DCs治疗aGVHD提供实验数据与理论依据。 方法:对三种不同片径GO进行表征，GO体外与小鼠骨髓来源imDCs共孵育48h，将不影响细胞增殖的最高剂量确定为GO的工作浓度;酶联免疫吸附法(ELISA)检测GO处理imDCs后细胞因子分泌水平;流式细胞术检测DCs共刺激分子、趋化因子受体表达水平和活性氧(ROS)含量;收集GO处理后的imDCs，并经脚垫过继性输注给小鼠，BLI监测细胞迁移速度及归巢模式;细胞免疫荧光法染色并比较各组imDCs微丝和微管的状态和分布。 结果:(1)应用透射电子显微镜(TEM)、动态光散射仪(DLS)、Zeta电位测试仪和原子力电镜(AFM)对三种片径尺寸GO纳米材料进行表征，发现三种GO均为单层氧化石墨烯材料，其厚度约1-2 nm，根据其片径尺寸分别将其命名为S(small，约为50-200 nm)、M(medial，约为200-500nm)和L（large，约为500-1500 nm）。共聚焦显微镜观察结果显示，GO处理过的imDCs细胞延展性更高，细胞间黏附现象较明显，并伸出大量丝状伪足，呈放射状朝四周排列，其中S-DCs组这一现象更为明显。而对照组细胞支架可变性较差，细胞间缺乏黏附。(9)流式细胞仪检测不同片径GO处理DCs体系ROS产生情况:S-DCs、M-DCs、L-DCs组产生的ROS平均荧光强度分别为274.52±13.44，244.51±7.78，243.53±27.58，均高于Ctrl-DCs组（165.51±10.62），差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论:采用不同片径GO处理imDCs，其表面共刺激分子CD40、CD80和CD86表达均上调，IL-6分泌明显上调，IL-1β、TNF-α和IL-12p70分泌受到抑制;GO显著上调CXCR4和CCR7的表达;活体成像结果显示，GO处理后DCs自脚垫迁移至腘窝淋巴结的速度相比对照组约提升1.5-3倍，迁移速率最快的是50-200 nm即小尺度GO处理的DCs;共聚焦显微镜下观察到GO处理后DCs微丝、微管重排及黏附现象明显，且能促进共孵育体系中活性氧的产生。由上述实验结果推测，GO促进DCs产生的ROS增强了DCs细胞支架重排和粘附现象，最终提升了DCs迁移及归巢能力。 第三部分:神经肽-氧化石墨烯诱导耐受性树突状细胞抑制急性移植物抗宿主病的作用研究 目的:以BALB/C（H-2Kd）为供体，C57BL/6J（H-2Kb）为受体，结合活体成像平台建立可视化aGVHD小鼠模型(BALB/C→C57BL/6J);设计并应用神经肽-氧化石墨烯体外诱导耐受性树突状细胞(tolerogenicdendritic cells，tDCs)，经尾静脉过继性输注至aGVHD模型小鼠，评价其抑制小鼠aGVHD的效果。 方法:酶联免疫吸附法(ELISA)检测四种神经肽处理imDCs在低剂量LPS刺激下细胞因子分泌水平，筛选出效果更优的神经肽UCN，并将其与GO偶联，监测复合物抑制DCs分泌促炎细胞因子情况，流式细胞术检测体系共刺激分子表达水平;CFSE标记BALB/C小鼠来源的T细胞，按比例与UCN-DCs或Ctrl-DCs混合培养72 h后，流式细胞仪检测T细胞增殖水平;收集各组UCN-GO处理后的imDCs，并经脚垫过继性输注给小鼠，BLI监测体内DCs细胞分布、迁移及归巢模式;将UCN-GO-DCs经尾静脉过继性输注至aGVHD模型小鼠，活体荧光成像观察萤火虫荧光素酶报告基因标记的T细胞在aGVHD小鼠体内增殖情况即aGVHD治疗效果。 结果:(1)低剂量LPS刺激下比较四种神经肽抑制DCs分泌促炎细胞因子的能力:UCN-DCs组分泌的促炎类细胞因子IL-12p70(63.55±9.19pg/mL vs.102.92±10.78 pg/mL)、IL-6(2386.76±524.44 pg/mL vs.27370.14±1640.17 pg/mL)、IL-1β(1248.70±34.33 pg/mL vs.1574.46±37.39 pg/mL)、TNF-α（27568.09±2706.38 pg/mL vs.35040.75±892.64 pg/mL）浓度均低于LPS-DCs对照组， P＜0.05，因此选用UCN诱导tDCs。综上，脚垫迁移模型中，不同处理方式DCs的迁移速率顺序为:UCN-L-DCs＞ UCN-S-DCs＞UCN-DCs＞Ctrl-DCs/S-DCs/L-DCs(ns:三者无明显差异)。(8)T细胞可视化aGVHD小鼠模型监测UCN-DCs抑制T细胞增殖的效果:在移植第6天时，各组小鼠体内总荧光强度均低于BM+Tc组(8.18×108±3.06×107)，Ctrl-DCs组、S-DCs组、L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为（1.23×108±1.54×107）、（1.29×108±1.41×107）、(1.47×108±1.41×107)，UCN-DCs组、UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组受鼠体内总荧光强度分别为（5.19×107±1.47×106）、（1.28×107±4.00×105）、(2.33×107±2.25×106);其中，UCN-DCs组总荧光强度低于Ctrl-DCs组，UCN-S-DCs组和UCN-L-DCs组总荧光强度低于UCN-DCs组，差异有统计学意义，P＜0.05，Ctrl-DCs组、S-DCs组和L-DCs组间无统计学差异，P＞0.05。 结论:UCN抑制DCs分泌促炎细胞因子能力显著高于另外3种神经肽，故选用UCN诱导tDCs进行后续实验。进一步研究发现UCN能明显抑制DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达，即UCN-DCs成熟度降低，暗示其激活T淋巴细胞的能力可能下降。CFSE-T细胞增殖实验表明UCN-DCs能诱导T细胞沉默，抑制其增殖。采用不影响DCs增殖的工作浓度即7.8μg/ml的GO与UCN高效偶联（偶联率约89％）后处理imDCs，体系细胞因子表达水平分析表明不同片径GO载体能有效递送UCN，并进一步增强其抑制DCs分泌促炎细胞因子的能力。后续脚垫输注模型及可视化模型数据显示，UCN-GO促进了DCs的局部迁移能力，初步证明其能有效地抑制T细胞在aGVHD小鼠体内增殖。综上，本研究为UCN-GO复合物诱导耐受性DCs抑制aGVHD提供了基础的实验数据和科学依据，具备潜在应用价值，可为临床转化提供参考。