【研究背景及目的】原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）是世界上最常见的恶性肿瘤之一。已明确的致病因素包括：乙肝和丙肝病毒感染、肝硬化、大量饮酒、黄曲霉素摄入等，但导致肝癌形成和进展的分子生物学机制还不完全明确。最近研究表明，在肝癌形成和发展过程中，DNA甲基化异常发挥着重要作用。肝细胞核因子4α（Hepatocyte nuclear factor-4α，HNF4α）是肝细胞核因子受体超家族中的一员，具有参与肝细胞白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成和脂肪代谢等重要功能。HNF4α共有9种亚型，分别由两个启动子调控转录产生，其中HNF4α1-6（统称为HNF4αP1）由P1启动子调控转录，P2启动子调控转录产生HNF4α7-9（统称为HNF4αP2）。转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一个多能性的细胞因子，在组织和器官的发育、纤维化以及细胞增殖、分化、生存和凋亡方面等发挥重要的生物学作用。TGF-β1对肿瘤生长有着双向调节作用，肿瘤早期TGF-β1可以诱导细胞凋亡，晚期则促进肿瘤生长，包括增加肿瘤的侵袭能力和促进EMT的形成。研究表明，TGF-β1在肝细胞分化和肝脏发育的不同阶段都起着非常重要的作用。本研究旨在探讨肝癌细胞中DNA甲基化对HNF4α表达的影响及其在TGF-β1调节HNF4α表达中的作用。【实验方法】一、人肝癌标本及肝癌细胞株中HNF4αP1和HNF4αP2表达的检测取20例手术切除人肝癌标本，以相应癌旁组织为对照，利用Real time PCR检测HNF4αP1、HNF4αP2的表达。Real time RT-PCR检测Hep3B、HepG2、Huh-7、YY等10种不同人肝癌细胞株中HNF4αP1、HNF4αP2表达。二、P1、P2启动子甲基化程度的检测选取HNF4αP1、HNF4αP2表达差异较大的几种人肝癌细胞株，利用亚硫酸盐测序法（bisulfite sequencing PCR BSP）检测P1启动子区基因片段甲基化程度，用甲基化特异性PCR（Methylmion Specific PCR MSP）法检测P2启动子区基因片段甲基化程度。三、5-AZA-CdR处理人肝癌细胞株后HNF4αP1、HNF4αP2表达的检测将人肝癌细胞株FOCUS以2×105/孔接种于6孔板，在含不同浓度5-脱氧杂氮胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine，5-AZA-CdR）（0.1μM、1μM、2.5μM）DMEM(含10%胎牛血清)中培养，设置空白对照组，每24小时更换相应培养基。37℃5%CO2培养箱培养72h后，收集细胞，BSP法检测P1启动子区甲基化程度，Real time PCR检测HNF4αP1、HNF4αP2表达。四、TGF-β1对人肝癌细胞株中HNF4α表达的调控将人肝癌细胞株Hep3B、HepG2、Huh-7、SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS以7×105/孔接种于6孔板，用相应培养基（含1%胎牛血清）将TGF-β1稀释，使其在培养孔的终浓度为2ng/ml，设置空白对照组，每24小时更换相应培养基。37℃5%CO2培养箱培养72h后，收集细胞，Real time PCR检测HNF4αP1的表达。五、DNA甲基化在TGF-β1调节HNF4αP1表达中的作用将人肝癌细胞株FOCUS以5×105/孔接种于6孔板，分为A、B、C、D四组，A组为空白对照组；B组1μM5-AZA-CdR处理6天；C组自第4天予2ng/ml TGF-β1处理，连续作用3天；D组前3天予1μM5-AZA-CdR处理，后3天予2ng/ml TGF-β1处理。每24小时更换相应培养基。37℃5%CO2培养箱培养6d后，收集细胞，Real time PCR检测HNF4αP1的表达。六、统计学处理数据采用SPSS11.0统计软件包进行分析，结果以X±S表示。多组间采用One-WayANOVA分析，方差齐性则采用非参数检验；P <0.05为具有统计学差异。【实验结果】一、人肝癌标本中HNF4αP1表达明显下降HNF4αP2表达明显上升Real time PCR检测20例肝癌与癌旁组织中HNF4αP1的表达量，结果显示：20例临床肝癌标本中，13例肝癌组织的HNF4αP1表达低于其癌旁组织（P<0.05），4例肝癌组织的HNF4αP1表达与癌旁组织无显著差别，另外3例肝癌组织的HNF4αP1表达高于癌旁组织（P<0.05）。Real time PCR检测20例肝癌与癌旁组织中HNF4αP2的表达量，结果显示：13例肝癌组织的HNF4αP2表达高于癌旁组织（P<0.05），2例肝癌组织的HNF4αP2表达与癌旁组织无显著差别，另外5例肝癌组织的HNF4αP2表达低于癌旁组织（P<0.05）。Real time PCR分别检测肝癌细胞株Hep3B、HepG2、Huh-7、YY、MHCC-H、MHCC-L、SMMC-7721、BEL-7405和FOCUS中HNF4αP1、HNF4αP2的表达，结果显示：HNF4αP1、HNF4αP2在Hep3B、HepG2、Huh-7中表达相对高，在SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS中表达相对低，其中Hep3B、HepG2、Huh-7中HNF4αP1平均表达量高于SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS900多倍(P<0.05)，而HNF4αP2在Hep3B、HepG2、Huh-7中平均表达量也较SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS高出近300倍(P<0.05)。二、HNF4αP1、HNF4αP2启动子甲基化状态与其表达呈负相关选取HNF4αP1、HNF4αP2表达差异较大的几种人肝癌细胞株，分别在HNF4α两个启动子区各取一基因片段，检测其甲基化状态，结果显示：BSP检测HNF4αP1、HNF4αP2表达较高的几种人肝癌细胞株如Hep3B、HepG2、Huh-7中P1的甲基化程度分别为3.6%、3%、2%，而HNF4αP1、HNF4αP2表达较低的几种人肝癌细胞株如SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS分别为88%、42%、64%，MSP检测Hep3B、HepG2、Huh-7中P2的甲基化程度也远远低于SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS。三、5-AZA-CdR使肝癌细胞株HNF4αP1、HNF4αP2表达明显上调用去甲基化药物5-AZA-CdR处理肝癌细胞株FOCUS72小时后检测P1甲基化状态，结果显示：FOCUS在去甲基化的药物作用72小时后P1启动子甲基化程度降低，而HNF4αP1、HNF4αP2表达明显上调，且均呈剂量依赖（P<0.05）。四、TGF-β1下调部分肝癌细胞株中HNF4αP1的表达TGF-β1分别处理肝癌细胞株Hep3B、HepG2、Huh-7、SMMC-7721、BEL-7405和FOCUS72h后检测HNF4αP1表达，结果显示：启动子区甲基化程度较低的Hep3B、HepG2、Huh-7在TGF-β1作用后HNF4αP1表达明显下调（P<0.05），而启动子区甲基化程度较高的SMMC-7721、BEL-7405、FOCUS在TGF-β1作用前后HNF4αP1表达无明显变化。五、DNA甲基化阻止TGF-β1调节HNF4αP1的表达5-AZA-CdR和TGF-β1联合或分别作用肝癌细胞株FOCUS，结果显示：单用5-AZA-CdR作用FOCUS（B组），与空白对照组（A组）相比HNF4αP1表达明显上调（P<0.05），而单用TGF-β1作用FOCUS（C组），与空白对照组（A组）相比HNF4αP1表达没有变化，先用5-AZA-CdR刺激FOCUS3d使其去甲基化后联合用TGF-β1处理（D组），结果与单用5-AZA-CdR处理（B组）相比HNF4αP1表达明显下调（P<0.05）。【结论】一、在肝癌中HNF4αP1表达上调，而HNF4αP2表达下调。二、DNA甲基化可能调控HNF4αP1、HNF4αP2在肝癌细胞株的表达。三、HNF4αP1启动子区甲基化可能阻止TGF-β1对HNF4αP1的调节作用。