宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,业已公认高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是宫颈癌发生的必备因素。HR—HPV主要通过早期癌蛋白E6和E7等,使宿主细胞某些癌基因活化、抑癌基因失活、表观遗传性改变、基因组失稳定性、端粒酶活性异常和引起病毒免疫逃避等多种机制,诱导宫颈正常上皮细胞异常增殖并发生恶性转化。　　 近年来,小分子RNA(miRNA)的发现为我们探索宫颈癌发生机制和防治策略带来新的启迪。MiRNA是一类小分子的非编码的单链RNA分子,约有20～24nt碱基构成,它通过其5’端6—7个核苷酸形成的“seed sequence”与多个靶基因的3’端非编码序列(UTR)互补配对而降解或抑制靶基因的表达。当前,miRNAs分子不仅参与了有机体的生长、发育、分化、代谢和死亡等几乎所有重要的生理过程,而且在多种病理性过程包括肿瘤中也发挥重要作用。对人类大多数肿瘤研究发现,miRNA分子在肿瘤组织中呈普遍的低表达状态,仅有少数miRNA分子表现为过度表达,因此认为一些miRNA分子可通过激活癌基因、下调抑癌基因诱导机体恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后。探讨miRNA在肿瘤病因、诊断及治疗中的作用也成为当前肿瘤研究的热点。　　 不仅人体可产生miRNA,一些致瘤病毒感染宿主后可诱导宿主细胞产生特异的miRNA分子表达谱改变,对病毒的复制、宿主细胞的转化产生正向或负向的调节作用。HR-HPV作为宫颈癌发生的关键生物学因素,也被报道可通过其病毒癌蛋白,调控宿主细胞miR-218、miR-23b、miR-203和miR-125b等一些细胞miRNA分子的表达,而参与宫颈细胞的恶性发生。但目前,这类研究仍处在起步阶段,尚有许多关键问题和具体机制未能阐明,研究HPV与miRNA之间的相互作用将为完善HPV致癌新机制并探寻阻断官颈癌发生的有效靶点提供科学和实验依据。　　 依据我们课题组前期miRNA芯片检测的基础,本研究首先探讨miR-100的表达异常在官颈癌发生中的可能作用并寻找其下游靶体,其次探寻HR-HPV E6／E7癌蛋白与miR-100在宫颈癌发生中的相互关系,最后研究HR-HPV E6癌蛋白调控经典的肿瘤抑制性miR-34a表达并参与宫颈癌发生的可能性并探寻可能的调控机制。　　 第一部分 MiR-100通过靶向PLK1蛋白表达参与官颈癌发生　　 目的:　　 通过对官颈病变组织和宫颈细胞株间miR-100的表达水平检测并进行体外功能试验及确定其下游靶分子,以期探讨miR-100表达异常与宫颈癌发生的相关性并揭示相关分子机制。　　 方法:　　 使用Stem—loop RT-PCR和Realtime PCR法检测了不同宫颈病变组织和宫颈细胞株间miR-100的表达水平。MiR-100 mimic或inllibitor调控了宫颈细胞株间miR-100的表达后,利用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪法检测细胞周期和凋亡情况,并利用Realtime PCR和Western-blot法检测了官颈细胞内预测靶体PLK1的mRNA和蛋白水平。最后使用免疫组化法检测了用于测定miR-100水平的相同宫颈组织中的PLK1蛋白表达,并分析miR-100与PLK1表达在宫颈组织间的相关性。　　 结果:　　 1、MiR-100在不同宫颈组织中的表达有显著性差异,两两比较CIN组织和宫颈癌组织中miR-100的水平较宫颈正常上皮组织是明显降低的,并且宫颈癌组织中miR-100的下降水平也较CIN组织的更为明显。进一步,我们对比了在不同CIN组织中miR-100的表达水平,结果显示CIN3组织中miR-100的表达水平较CIN1和CIN2两组明显下降,但在CIN1和CIN2两组之间,miR-100的表达没有明显差异。　　 2、所有HPV阳性的宫颈癌细胞株miR-100的表达水平较宫颈正常细胞株Hacat相比明显降低,而HPV阴性的宫颈癌细胞株C33A则没有明显改变　　 3、MiR-100的表达增加降低了Siha和Caski细胞的增殖能力,并诱导了早期凋亡；而miR-100的表达下降促进了Hacat细胞增殖,并减少了其早期凋亡率。　　 4、MiR-100的表达增加降低了Siha和Caski细胞内PLK1蛋白的表达水平,但mRNA水平没有明显改变；而miR-100的表达下降上调了Hacat细胞内PLK1的蛋白水平,但不影响其mRNA表达。　　 5、PLK1在宫颈正常上皮组织到CIN组织再到SCC组织,表达逐渐增强,而且miR-100的表达与PLK1的表达呈显著的负性相关,这种相关性主要发生在宫颈高级别病变中。　　 6、MiR-100表达变化影响了宫颈细胞G2／M期的传递。　　 结论:　　 1、MiR-100在高级别CIN和宫颈癌中表达下调,并通过改变细胞增殖、凋亡和细胞周期参与了宫颈癌发生。　　 2、PLK1是miR-100负向调控的靶分子,由miR-100失抑制引起的PLK1高表达是宫颈癌发生的机制之一。　　 第二部分 HR-HPV E6／E7癌蛋白与miR-100在宫颈癌发生中的相关性探讨　　 目的:　　 通过对HR-HPV感染与否的宫颈正常组织miR-100的表达水平检测并调控HPV-16 E6／E7后检测miR-100变化,以期明确miR-100在宫颈癌发生过程中的表达下调是否由HR-HPV E6／E7癌基因调控所致。　　 方法:　　 使用Stem-loop RT—PCR和Realtime PCR检测了HR-HPV感染与否的宫颈正常组织中miR-100的表达水平。使用HPV-16 E6／E7表达质粒在Hacat细胞内异位表达HPV-16 E6／E7,利用RT-PCR和免疫荧光法分别检测到HPV-16 E6／E7的mRNA和蛋白水平,然后检测细胞内miR-100的改变。使用HPV-16 E6／E7启动子靶向siRNAs下调Siha和Caski细胞内HPV-16 E6／E7,Realtime PCR验证抑制效率,然后检测细胞内miR-100的水平。　　 结果:　　 1、HR-HPV感染组的宫颈正常上皮组织中miR-100的表达水平较未感染组略有下降,但无明显统计学差异。　　 2、HPV-16 E6／E7表达质粒转染Hacat细胞后,RT-PCR和免疫荧光法检测到HPV-16 E6／E7的mRNA和蛋白表达。　　 3、HPV-16 E6／E7表达质粒转染Hacat细胞24、48和72h后,在各个时间点,转染组miR-100表达水平与空白对照组和阴性对照组比较,都无显著性差异。　　 4、使用HPV-16 E6／E7启动子靶向siRNAs下调Siha和Caski细胞内HPV-16E6／E7,Realtime PCR法确定Siha细胞的抑制效率约为40％,Caski细胞的抑制效率约为60％。　　 5、HPV-16 E6／E7启动子的靶向siRNAs转染入Siha或Caski细胞48h后,干扰组miR-100表达水平与空白对照组和阴性对照组相比,也无显著性差异。　　 结论:　　 1、HR—HPV E6／E7癌蛋白不直接调控宿主细胞miR-100表达,在宫颈癌发生过程中miR-100表达下调可能是多种因素综合作用的结果。　　 第三部分 HR-HPV E6癌蛋白通过P53途径抑制miR-34a表达并参与宫颈癌早期发生　　 目的:　　 在对比HR-HPV感染与否的宫颈正常组织和CIN组织以及宫颈癌组织中primary-miR-34a的表达水平基础上通过体外实验探讨其可能的调控机制,以期确定HR-HPV调控miR-34a表达参与宫颈癌发生的可能性。　　 方法:　　 使用RT-PCR半定量法检测了HR-HPV感染与否的不同宫颈组织间primary-miR-34a的表达水平。使用HPV-16 E6／E7表达质粒在293T细胞内异位表达HPV-16 E6,利用RT-PCR和免疫荧光法分别检测到HPV-16 E6的mRNA和蛋白水平,然后利用RT-PCR半定量法和Western-blot法检测细胞内primary-miR-34a和P53蛋白的改变。使用HPV-16 E6编码区靶向siRNAs下调Siha细胞内HPV-16E6,Realtime PCR验证抑制效率,然后检测细胞内primary-miR-34a和P53蛋白的水平。　　 结果:　　 1、Primary-miR-34a在不同宫颈组织中的表达有显著性差异,两两比较,CIN组织和宫颈癌组织中primary-miR-34a的表达水平较宫颈正常上皮组织明显下降,并且宫颈癌组织中primary-miR-34a的水平比CIN组织中表达更低,尽管无明显统计学差异。进一步,对比不同CIN组织中primary-miR-34a的表达水平,CIN2和CIN3组织中primary-miR-34a的表达水平较CIN1组逐渐下降,但在CIN2和CIN3两组之间,primary-miR-34a的表达没有明显变化。同时我们也检测了不同分期宫颈癌中primary-miR-34a的表达情况,Ⅰ期宫颈癌中primary-miR-34a的表达水平与Ⅱ期宫颈癌相比无明显统计学差异。　　 2、HR-HPV感染的宫颈组织其Primary-miR-34a的水平较未感染组显著下降。通过对宫颈组织依据病变程度进行分层,在宫颈正常组织和CIN组织中,HR-HPV感染组均较未感染组Primary-miR-34a的表达明显降低。　　 3、HPV-16 E6／E7表达质粒转染293T细胞后,RT-PCR和免疫荧光法检测到HPV-16 E6的mRNA和蛋白水平。HPV-16 E6／E7表达质粒稳定转染293T细胞48h后,转染组其Primary-miR-34a和P53蛋白水平均较空白组和阴性组显著下降。　　 5、使用HPV-16 E6编码区靶向siRNAs下调Siha细胞内HPV-16 E6,RealtimePCR法确定抑制效率约为60％。　　 6、HPV-16 E6编码区靶向siRNAs转染Siha细胞48h后,干扰组其Primary-miR-34a和P53蛋白水平均较空白组和阴性对照组显著升高。　　 结论:　　 1、MiR-34a是HR-HPV E6调控的细胞miRNA,E6引起的miR-34a表达下调可发生在形态学改变之前,是宫颈癌发生的早发事件。　　 2、P53途径介导了HR-HPV E6对miR-34a的调控。