泛素系统已经被确定为大多数细胞调节过程的关键调节因素,包括蛋白质降解,DNA修复,基因转录,细胞周期控制,内吞作用和自噬等。泛素在癌细胞中经常发生变化,一些肿瘤抑制因子和致癌基因是泛素结合和去结合途径的酶。泛素主要与赖氨酸残基连接,也可以与其他底物蛋白N末端的氨基结合。泛素化由3种酶组成,分别为E1泛素活化酶,E2泛素结合酶,E3泛素连接酶,三种酶协调介导共同完成特定蛋白的泛素化过程。MDM2蛋白即是一种E3泛素连接酶。24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)在胆固醇生物合成、氧化应激反应、神经保护、抗凋亡和抗炎性等方面发挥重要作用。DHCR24也参与多种疾病的调节过程,如心血管疾病,癌症(前列腺癌)和丙型肝炎等。DHCR24发挥其重要的生物学功能可能是通过DHCR24与其他蛋白相互作用的结果。本实验组之前的实验以DHCR24为诱饵蛋白,采用生物信息学技术预测及免疫共沉淀联合蛋白质谱技术确定了一些与其能发生相互作用的候选蛋白,MDM2蛋白即是其中之一。为了研究DHCR24与MDM2蛋白之间相互作用的可能分子机制,本课题利用免疫共沉淀实验确认MG132对DHCR24的泛素化修饰情况的影响,并采用生物信息学的蛋白对接技术分析DHCR24与MDMD2相互作用的可能分子机制,为进一步研究DHCR24及与DHCR24相互作用蛋白提供新思路。我们对PC12神经细胞转染驱动DHCR24过表达的重组腺病毒,并施加蛋白酶抑制剂MG132处理,之后收集总蛋白进行免疫共沉淀实验,结果证明在神经系统中MG132能够增强DHCR24的泛素化修饰。进一步的实验证明,DHCR24蛋白酶体降解通路的阻断能显著加强其神经保护作用。然后,我们利用蛋白泛素化修饰位点的3个预测软件UbiPred、UbPred、CKSAAP_UbSite分别对DHCR24蛋白的泛素化位点进行预测。综合分析结果,DHCR24蛋白K301、K306、K367、K427可能为其被MDM2泛素化修饰的位点。为了进一步研究DHCR24与其相互作用蛋白MDM2的相互结合的具体模式,我们采用蛋白对接服务器Z-DOCK进行DHCR24与MDM2蛋白的对接。结果显示,在两种不同的对接策略中,DHCR24与MDM2蛋白相互作用方式基本相同。即MDM2蛋白主要通过DHCR24氨基酸序列中的Y298-K312和T332-D341序列与DHCR24发生相互作用,表明DHCR24序列中的Y298-K312和T332-D341在DHCR24与MDM2蛋白的结合中发挥至关重要的作用。综上所述,本课题对DHCR24与MDM2蛋白的相互作用可能的分子机制进行了研究,确认了MG132能够增强DHCR24的泛素化修饰水平,且其泛素化修饰的增强能加强其神经保护作用。我们也预测了DHCR24发生泛素化修饰可能的位点及DHCR24与MDM2相互作用可能的分子机制。本研究不仅为DHCR24与MDM2蛋白的相互作用机制提供了新的理论依据,而且也为将DHCR24开发为神经保护作用的基因治疗药物提供了新的思路。