原发性肝癌（HCC）发病率在全球癌症发病率中排名第六,死亡率位居第三位,未来五年,肝癌发病率将超过百万例,其中HCC的比例将高达90%。中药方剂是中国传统医学的珍宝,中医药在防治肝脏疾病中发挥了重要作用,尤其在免疫激活、炎症改善、代谢调节等方面具有独特的作用。甘遂半夏汤是临床经典名方,出自《金匮要略》,由甘遂、半夏、白芍、甘草、白蜜五味药组成,属峻下逐水药。目前,对该方的研究主要围绕在甘遂-甘草配伍的“毒-效”评价方面,而对组方在抗肝癌方面的有效性及作用机理的研究甚少,尤其从免疫角度探析复方抗肝癌的作用机制研究尚属空白。故此,我们对复方的抗肝癌作用、药效物质及其分子机制进行了系统的研究。首先,建立H22小鼠皮下移植瘤和腹水瘤模型来评价甘遂半夏汤水提和醇提物的作用效果。结果显示,在皮下移植瘤模型中,不同浓度醇提物对肿瘤体积增长的抑制率介于（63.00±1.24）%至（70.50±0.70）%之间,不同浓度水提物对肿瘤体积的抑制率介于（20.50±0.70）%至（69.50±2.12）%之间。在小鼠腹水瘤模型中,高剂量醇提物对腹水的抑制率为（53.57±4.84）%,高剂量水提物的抑制率为（71.43±4.87）%。这意味着醇提物抑制小鼠皮下移植瘤的效果优于水提物,而水提物抑制腹水增长的效果却优于醇提物。同时发现,荷瘤小鼠去瘤脾脏指数与模型存在相关性,皮下移植瘤模型中去瘤脾脏指数与肿瘤大小呈正相关,腹水瘤模型中去瘤脾脏指数与腹水体积呈负相关,而药物治疗可维持小鼠脾脏正常的大小及形态,去瘤脾脏指数为（6.21±2.64）mg/g至（7.65±4.01）mg/g,与模型组比较具有显著性差异（P＜0.05）。甘遂半夏汤提取物抑制LPS诱导下巨噬细胞产生的大量炎性细胞因子,如白介素1β（IL-1β）、IL-6等,同时显著下调核因子κB（NF-κB）的激活和核转位,发挥抗炎作用,醇提物的活性强于水提物。UHPLC-Q/TOF-MS分析结果显示,复方醇提物中主要含有萜类及黄酮类化合物。共鉴定出44种化合物,包括19种萜类、13种黄酮类、1种查尔酮、2种类固醇、2种单宁和1种激素等,萜类主要来源于甘遂,黄酮类主要来源于甘草。复方醇提物的抗肿瘤研究结果显示,其具有抑制肿瘤增长及调节免疫细胞的双重作用。可显著抑制肿瘤及脾脏中T、B细胞的减少,可以抑制CD11b+-F4/80+巨噬细胞的分化,促进NK1.1+细胞在组织中的浸润,抑制Gr+-Ly6C+/Ly6G+髓源性免疫抑制细胞（MDSCs）的募集。结合网络药理学分析结果通过动物实验验证,醇提物下调信号转导和转录激活因子3（STAT3）-蛋白激酶B（AKT）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路发挥抗肝癌及抑制MDSCs细胞的增殖和在组织中积累,改善肿瘤微环境,进一步发挥抗肝癌的作用。基于甘遂的药效及复方化学成分分析结果,课题组对甘遂的化学成分进行了系统的研究,共从甘遂中分离鉴定得到91个化合物,其中包括三萜类化合物21个,二萜类化合物49个,甾体类化合物12个,以及其他类型化合物9个。我们对12个甾体类和58个萜类化合物进行了抗Hep G2活性和抗炎活性筛选,其中5个C21甾体类及17个萜类化合物具有抗Hep G2活性。对抗肝癌活性最强的cynsaccatol L（5）进行作用机制研究。发现,5可显著抑制Hep G2细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制B细胞淋巴瘤基因-2（Bcl-2）的表达,上调Bcl-2相关X蛋白（Bax）、剪切后半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase 3）和8（cleaved caspase8）的表达。基于5的分子构型,我们重点研究了5对钠钾ATP酶α1亚基（ATP1A1）的作用,发现5可促进ATP1A1蛋白内吞后经溶酶体降解,促进蛋白的泛素化;下调ATP1A1依赖的AKT-ERK信号通路,并可与ATP1A1活性口袋α1-4链氨基酸残基结合,抑制钠钾泵活性,发挥促进Hep G2细胞凋亡的作用。结合5对巨噬细胞的调节作用,体外共培养实验结果显示,5可抑制肿瘤为环境下巨噬细胞向M2型的极化,增强巨噬细胞的吞噬能力,调节细胞因子的释放,进而促进Hep G2细胞的凋亡。同时,5表现出了抑制MDSCs增殖并下调胞内STAT3/AKT/ERK信号通路的作用。基于复方所体现出的免疫调节活性以及炎症在疾病进展中的相关性,我们对具有抗Hep G2增殖活性的17个萜类化合物进行抗炎活性的筛选,发现11个化合物具有抗Hep G2及抗炎活性。其中20-O-Acetylingenol-3-angelate（AAI）对LPS诱导下巨噬细胞产生NO的半数抑制率浓度(IC50)仅为0.015μM,活性高出阳性药物1000倍以上。故而,我们对AAI的抗炎机制进行下一步研究,发现AAI可抑制LPS诱导下IL-6和IL-1β的高表达,呈剂量-效应关系;还可抑制诱导型一氧化氮合酶（i NOS）的表达和核转录因子（NF-κB）的核转位;通过抑制蛋白激酶Cδ亚基（PKC-δ）/ERK的活化,从而抑制巨噬细胞向M1型的极化,发挥抗炎作用。建立IL-4刺激的巨噬细胞M2模型,AAI显著下调精氨酸酶1（ARG-1）、血红蛋白清道夫受体（CD163）、肿瘤生长因子β（TGF-β）和1型整合膜糖蛋白受体（CD206）的表达,抑制STAT6的激活和PKC/ERK和AKT1信号通路,抑制巨噬细胞向M2型的极化。综上所述,AAI促进M1和M2型巨噬细胞向M0极化。在与肿瘤细胞共培养条件下,AAI一方面促进了Hep G2细胞的凋亡,另一方面抑制肿瘤环境下M2型巨噬细胞的极化,提高巨噬细胞分泌炎性细胞因子的能力。另外,AAI可抑制MDSCs增殖及胞内PKC-δ/MAPK信号通路。综上所述,（1）甘遂半夏汤具有抑制H22小鼠皮下移植瘤和癌性腹水的作用,醇提物抗肝癌效果优于水提物,且具有维持小鼠脾脏形态和大小的作用;（2）复方醇提物的药效物质主要为萜类及黄酮类化合物,萜类主要来源于甘遂,黄酮类主要来源于甘草;（3）醇提物通过抑制肿瘤组织及MDSCs中STAT3/AKT/ERK信号通路,发挥抗肝癌及调节免疫抑制细胞的双重作用;（4）来源于甘遂的5个C21甾体类及17个二萜类化合物具有抗Hep G2活性。C21甾体cynsaccatol L与钠钾ATP酶结合,通过抑制离子泵活性及降低ATP1A1表达,下调ATP1A1依赖的AKT-ERK信号通路,从而诱导细胞凋亡,在肿瘤微环境中提高巨噬细胞的吞噬能力和细胞因子的释放发挥辅助抗肿瘤作用;（5）巨大戟烷型二萜AAI通过调节PKC-δ/ERK、NF-κB、STAT6等多条信号通路调节巨噬细胞M1和M2型的平衡。在肿瘤微环境中,AAI抑制巨噬细胞向M2型的极化,减少细胞因子的释放（如IL-6、IL-10）,增强巨噬细胞的吞噬能力,从而促进Hep G2细胞的凋亡。本论文研究内容,为中药复方的免疫抗肿瘤作用研究提供了新思路和新方法,为甘遂半夏汤的临床应用和药物开发提供了理论基础和数据支持。