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第1章：骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定
目的：利用Cre/loxP重组酶系统构建骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠，为研究骨髓细胞CCR3基因敲除在变应性鼻炎发病中的作用提供动物模型。
方法：
1、构建CCR3打靶载体：首先构建CCR3-RV载体，然后BAC插入loxP-neo-loxP片段，将线性化的CCR3-RV转入CCR3-BAC-loxP宿主菌，套取目的片段后将正确的RV-CCR3-loxP质粒转入Ara-EL350，进行Cre/loxPpopout去除Neo标记，接着插入FRT-neo-FRT-loxP片段。
2、通过电转的形式转入ES细胞中，通过PCR和Southern鉴定；筛选出正确同源重组的ES克隆，经过囊胚注射，最终获得可遗传的CCR3基因条件性敲除的flox杂合子小鼠。
3、将CKO的杂合小鼠(fln/wt)与全身表达Flper的品系交配，去除Neo得到CKO模型(fl/wt)；将fl/wt小鼠与骨髓细胞特异性Cre工具鼠交配，获得特异性敲除骨髓细胞CCR3基因的模型。因为全身表达Flper的工具鼠敲除效率不是100%，所以得到的杂合子小鼠需要与C57BL/6小鼠回交一代后在后代的小鼠中分离出neo完全删除的杂合子小鼠即为目的鼠。
4、通过PCR鉴定子代小鼠基因型。
结果:
1、质粒结果及酶切结果证明CCR3打靶载体构建成功。
2、PCR和Southern鉴定结果表明胚胎干细胞阳性克隆成功，即发生了同源重组，可获得可遗传的CCR3基因条件性敲除的flox杂合子小鼠。
3、子代小鼠基因型鉴定结果说明成功敲除该小鼠骨髓细胞CCR3基因。
结论：通过Cre/loxP系统成功构建了骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠模型，为进一步研究其在变应性鼻炎中的应用奠定基础。
第2章：骨髓细胞CCR3基因敲除小鼠动物模型在变应性鼻炎中的应用研究
目的：通过上述实验获得条件性敲除骨髓细胞CCR3基因小鼠模型，利用此动物模型研究条件性敲除骨髓细胞CCR3基因后对变应性鼻炎小鼠症状、主要器官组织的形态学异同、体重、胸腺指数及脾脏指数等的影响。
方法：将C57BL/6小鼠分为6组：空白对照组(WB组,wildtypeblank组)、变应性鼻炎组(WA组，wildtypeAR组)、同窝野生对照组(FB组，FL/FLblank
组)、同窝野生变应性鼻炎组(FA组，FL/FLAR组)、条件敲除CCR3基因空白组(CB组，CCR3-/-blank组)，条件敲除CCR3基因变应性鼻炎组(CA组，CCR3-/-AR组)。以卵清蛋白(OVA)致敏、采用局部滴鼻给药的方式激发，建立变应性鼻炎小鼠模型，对照组以等量PBS给药。末次鼻腔激发后对各组小鼠进行症状学评估，并收集各组小鼠的外周血、鼻粘膜及内脏标本。测量小鼠胸腺指数及脾脏指数以评估小鼠体内细胞免疫及体液免疫。采用HE染色评估鼻粘膜、肺、脾脏、胸腺、肝脏、心脏及肾脏的病理形态学改变。应用Elisa方法测定小鼠外周血及鼻腔灌洗液中OVA-sIgE的浓度变化。
结果:
1、基因敲除组小鼠变应性鼻炎症状减轻、体重下降减轻。
2、脾脏指数在OVA刺激下上升，胸腺指数在基因敲除及OVA作用下均上升。
3、HE染色显示各实验组小鼠心脏、肾脏未见明显病理形态学差异；条件敲除骨髓细胞CCR3基因可减轻小鼠鼻黏膜、肺及肝脏的炎性细胞及嗜酸性粒细胞浸润程度，改善脾脏和胸腺的结构紊乱。
4、条件敲除骨髓细胞CCR3基因可降低变应性鼻炎小鼠外周血和鼻腔灌洗液中OVA-sIgE浓度。
结论：利用条件基因敲除的方法敲除小鼠骨髓细胞CCR3基因后，可减轻变应性鼻炎小鼠的症状，减少变应性鼻炎引起的体重下降，并提高变应性鼻炎小鼠机体免疫能力，改善主要效应器官的结构紊乱，因此，CCR3基因可做为靶基因应用于变应性鼻炎基因的治疗。
目的：利用Cre/loxP重组酶系统构建骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠，为研究骨髓细胞CCR3基因敲除在变应性鼻炎发病中的作用提供动物模型。
方法：
1、构建CCR3打靶载体：首先构建CCR3-RV载体，然后BAC插入loxP-neo-loxP片段，将线性化的CCR3-RV转入CCR3-BAC-loxP宿主菌，套取目的片段后将正确的RV-CCR3-loxP质粒转入Ara-EL350，进行Cre/loxPpopout去除Neo标记，接着插入FRT-neo-FRT-loxP片段。
2、通过电转的形式转入ES细胞中，通过PCR和Southern鉴定；筛选出正确同源重组的ES克隆，经过囊胚注射，最终获得可遗传的CCR3基因条件性敲除的flox杂合子小鼠。
3、将CKO的杂合小鼠(fln/wt)与全身表达Flper的品系交配，去除Neo得到CKO模型(fl/wt)；将fl/wt小鼠与骨髓细胞特异性Cre工具鼠交配，获得特异性敲除骨髓细胞CCR3基因的模型。因为全身表达Flper的工具鼠敲除效率不是100%，所以得到的杂合子小鼠需要与C57BL/6小鼠回交一代后在后代的小鼠中分离出neo完全删除的杂合子小鼠即为目的鼠。
4、通过PCR鉴定子代小鼠基因型。
结果:
1、质粒结果及酶切结果证明CCR3打靶载体构建成功。
2、PCR和Southern鉴定结果表明胚胎干细胞阳性克隆成功，即发生了同源重组，可获得可遗传的CCR3基因条件性敲除的flox杂合子小鼠。
3、子代小鼠基因型鉴定结果说明成功敲除该小鼠骨髓细胞CCR3基因。
结论：通过Cre/loxP系统成功构建了骨髓细胞CCR3基因条件性敲除小鼠模型，为进一步研究其在变应性鼻炎中的应用奠定基础。
第2章：骨髓细胞CCR3基因敲除小鼠动物模型在变应性鼻炎中的应用研究
目的：通过上述实验获得条件性敲除骨髓细胞CCR3基因小鼠模型，利用此动物模型研究条件性敲除骨髓细胞CCR3基因后对变应性鼻炎小鼠症状、主要器官组织的形态学异同、体重、胸腺指数及脾脏指数等的影响。
方法：将C57BL/6小鼠分为6组：空白对照组(WB组,wildtypeblank组)、变应性鼻炎组(WA组，wildtypeAR组)、同窝野生对照组(FB组，FL/FLblank
组)、同窝野生变应性鼻炎组(FA组，FL/FLAR组)、条件敲除CCR3基因空白组(CB组，CCR3-/-blank组)，条件敲除CCR3基因变应性鼻炎组(CA组，CCR3-/-AR组)。以卵清蛋白(OVA)致敏、采用局部滴鼻给药的方式激发，建立变应性鼻炎小鼠模型，对照组以等量PBS给药。末次鼻腔激发后对各组小鼠进行症状学评估，并收集各组小鼠的外周血、鼻粘膜及内脏标本。测量小鼠胸腺指数及脾脏指数以评估小鼠体内细胞免疫及体液免疫。采用HE染色评估鼻粘膜、肺、脾脏、胸腺、肝脏、心脏及肾脏的病理形态学改变。应用Elisa方法测定小鼠外周血及鼻腔灌洗液中OVA-sIgE的浓度变化。
结果:
1、基因敲除组小鼠变应性鼻炎症状减轻、体重下降减轻。
2、脾脏指数在OVA刺激下上升，胸腺指数在基因敲除及OVA作用下均上升。
3、HE染色显示各实验组小鼠心脏、肾脏未见明显病理形态学差异；条件敲除骨髓细胞CCR3基因可减轻小鼠鼻黏膜、肺及肝脏的炎性细胞及嗜酸性粒细胞浸润程度，改善脾脏和胸腺的结构紊乱。
4、条件敲除骨髓细胞CCR3基因可降低变应性鼻炎小鼠外周血和鼻腔灌洗液中OVA-sIgE浓度。
结论：利用条件基因敲除的方法敲除小鼠骨髓细胞CCR3基因后，可减轻变应性鼻炎小鼠的症状，减少变应性鼻炎引起的体重下降，并提高变应性鼻炎小鼠机体免疫能力，改善主要效应器官的结构紊乱，因此，CCR3基因可做为靶基因应用于变应性鼻炎基因的治疗。