【摘 要】
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目的：构建人TWEAK基因真核表达载体pcDNA3.1（+）-TWEAK，转染HepG2细胞，初步研究该基因对HepG2细胞的作用，为进一步研究TWEAK的功能奠定基础。方法：以pORF5-hTWEAK质粒为DNA模板，PCR法扩增人TWEAK全长基因，连接至原核表达载体pET32a（+），转化大肠杆菌JM109，提取质粒经PCR、双酶切（XholⅠ和HindIII）和测序鉴定。将TWEAK片段插
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目的：构建人TWEAK基因真核表达载体pcDNA3.1（+）-TWEAK，转染HepG2细胞，初步研究该基因对HepG2细胞的作用，为进一步研究TWEAK的功能奠定基础。方法：以pORF5-hTWEAK质粒为DNA模板，PCR法扩增人TWEAK全长基因，连接至原核表达载体pET32a（+），转化大肠杆菌JM109，提取质粒经PCR、双酶切（XholⅠ和HindIII）和测序鉴定。将TWEAK片段插入真核表达载体pcDNA3.1（+）中，构建pcDNA3.1（+）-TWEAK重组质粒，经过酶切鉴定后，采用脂质体转染法转入HepG2细胞中，设空白对照组、脂质体组和pcDNA3.1（+）组为阴性对照组，同时设pORF5-hTWEAK为阳性对照组。通过MTT法测定细胞增殖变化，通过RT-qPCR检测TWEAK、Fn14、caspase-8、bcl-2和bax基因表达，通过Western blot检测TWEAK、NF-κB1和MAPK3的蛋白表达水平。结果：原核表达载体pET32a-TWEAK构建后，通过PCR、双酶切和基因序列测定鉴定，成功地将TWEAK全长基因序列750bp转入pET32a（+）。通过酶切、连接和转化，将TWEAK转入真核表达载体pcDNA3.1（+），构建pcDNA3.1（+）-TWEAK重组质粒。重组质粒转染人HepG2细胞后，MTT测定发现pcDNA3.1（+）-TWEAK转染组细胞增殖较阴性对照组受到抑制（P<0.05）；通过RT-qPCR检测发现转染pcDNA3.1（+）-TWEAK质粒后Fn14和caspase-8mRNA相对表达量较阴性对照组增加（P<0.05），bax/bcl表达比例增加；通过Western blot检测发现TWEAK和NF-κB1的蛋白表达量在pcDNA3.1（+）-TWEAK质粒转染细胞中高表达（P<0.05）。结论：成功构建了pcDNA3.1（+）-TWEAK真核表达载体；重组质粒转染入HepG2细胞后，TWEAK在HepG2细胞中有效表达，诱导Fn14、NF-κB1、caspase-8和bax/bcl-2表达增加，同时细胞增殖受到抑制，初步表明TWEAK在HepG2细胞中可通过影响细胞凋亡机制而抑制细胞生长，调控TWEAK的表达有望成为一种治疗肝癌的新方法。
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