子痫前期(Pre-eclampsia, PE)为怀孕前血压正常的孕妇在妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿,又称为先兆子痫。PE影响着全世界3%-5%的孕妇,是导致母儿患病率和死亡率的主要原因,分别占产妇及胎儿死因的20%、40%。资料显示我国PE发生率约2-8%,晚近发生率呈逐年增长趋势。PE不仅可影响妊娠结局,也影响产妇及子代的远期预后。PE的新生儿可发生包括早产,胎儿生长受限,缺氧相关的神经损伤,围生儿死亡等并发症,其日后发生心脏病的风险增加；PE孕妇发生心血管和脑血管疾病的机率亦增加等。目前认为,异常的胎盘形成发生在妊娠早期导致胎盘缺血(Ⅰ期)；缺血的胎盘在妊娠晚期可分泌可溶性因子从而引起系统性内皮功能紊乱和PE综合征(Ⅱ期)。在PE发生之前,孕妇的血浆成分已经出现了诸多变化,因此,有许多针对预测PE的生物标记物如胎盘激素、血管生成因子、脂质进行的研究。但既往这些生物标记物在PE预测方面的研究多为针对可能导致PE发生的信号转导通路分子的研究,且多为单一标记物的预测研究。而且,由于PE是一异质性疾病,临床表现多样化,应用单一标记物预测的可能性不大。故至今为止尚无一个标记物或者几个联合标记物预测能达到临床应用所需要的灵敏度和特异度,因此这些检测均未能在临床常规开展。DNA的甲基化检测具有稳定性好的优点,因此既往有诸多针对不良妊娠结局DNA甲基化研究,但这些研究多是基于单一位点或胎盘的甲基化改变的检测,尚无对PE母体外周血全基因组所有位点的甲基化检测报道。在PE的发生过程中存在胎盘DNA甲基化异常,因此通过检测孕妇外周血差异甲基化基因可能成为预测PE发生的新的标记物。本研究采用前瞻性队列研究设计收集孕妇外周血,应用甲基化芯片筛选、焦磷酸测序验证PE差异甲基化DNA；检测母体外周血差异甲基化DNA在正常孕妇与PE孕妇随孕周的甲基化变化情况；研究和探讨外周血差异甲基化基因作为作为预测PE发生的新的标记物的早期预测价值。第一章PE母体外周血差异甲基化DNA的筛选及检测[目的]胎盘DNA甲基化异常参与了PE的发生,母体外周血差异甲基化DNA可能做为无创性预测PE发生的新的标记物。应用前瞻性队列研究方法,采用甲基化芯片技术筛选母体外周血差异甲基化DNA,研究其在正常孕妇与PE孕妇随孕周改变的甲基化变化,筛选可预测PE的候选基因。[方法]研究对象为2012年10月-2013年11月期间在南方医科大学附属深圳妇幼保健院从孕早期建立妊娠期保健手册开始定期产前检查,并最终在本院分娩的孕妇共1752例,分为早发型PE组、晚发型PE组、正常对照孕妇组(对照组)三组。参照入选标准及排除标准,匹配对照组孕妇年龄、孕产次等基本资料,各组3例抽提其孕早期、孕中期及入院分娩时(孕晚期)血标本DNA,应用人全基因组DNA甲基化芯片对其DNA甲基化程度进行测定。对比识别早发型PE组、晚发型PE组和对照组的差异甲基化DNA。以限定的P值(<0.05)和M值(>1.0或小于-1.0)作为切割值,筛选出各组的差异甲基化DNA。利用DAVID数据库等分析差异基因主要参与影响的信号通路及调控范围；根据聚类分析后各信号通路的相对重要性、基因功能注释及既往文献报道中与PE发病机制相关基因,筛选出外周血中可能参与PE发病的甲基化差异DNA。[结果]1.在孕早、中、晚三个时间段,正常对照组中的整体甲基化程度略有变化,孕早期血的甲基化程度最低；与对照组比较,早发型PE组、晚发型PE组的孕早期甲基化程度呈增高趋势。2.孕早期血甲基化结果：(1)与对照组比对,早发型PE组共发现34713个差异甲基化位点,其中矫正后有统计学差异位点1303个；(2)与对照组比对,晚发型PE组共发现24625个差异甲基化位点,其中矫正后有统计学差异的位点648个；(3)早发型PE组、晚发型PE组及对照组同时满足探针位于CpGs岛并分布在5’UTR或TSS区域的共同差异甲基化基因11个(C22orf45、UPB1、MTNR1A、PLEKHG5、BLCAP、HOXA9、TUBGCP5、ZNF492、PSKH2、 MBP及PIWIL1)。3.孕中期血甲基化结果：(1)与对照组比对,早发型PE组共发现42243个差异甲基化位点,其中矫正后有统计学差异的位点1176个；(2)与对照组比对,晚发型PE组孕中期血共发现24241个差异甲基化位点,其中矫正后有统计学差异的位点共479个；(3)早发型PE组、晚发型PE组及对照组同时满足探针位于CpGs岛并在分布在5’UTR或TSS区域共有17个共同差异甲基化基因(FBXO39、EPHA5、ZNF542、HOXD1、BOLL、HCN1、CHRNB1、GLP1R、GABRG3、 NKAIN3、NTSR2、CCK, C17orf51、UCP1、SNAP25、MTNR1A、LPPR3)4.孕晚期血甲基化结果：(1)与对照组比对,早发型PE组共发现42847个差异甲基化位点,其中矫正后有统计学差异的位点共1133个；(2)与对照组比对,晚发型PE组共发现25157个差异甲基化位点,其中矫正后有统计学差异的位点共有491个；(3)早发型PE、晚发型PE及对照组同时满足探针位于CpGs岛并在分布在5’UTR或TSS区域的共有19个基因(PAK7、MOSC2、SHE、TDRD10、UNC5D、CHL1、GRM1、PPAP2C、UGT8、CCK、C17orf51、PAX1、 PUS3、DDX25、NPY2R、SLC7A14、HLA-A、DPP6、DSC2)[小结]利用人全基因组DNA甲基化芯片成功检测了孕早、中、晚三期的早发型PE组、晚发型PE及对照组外周血DNA甲基化,结果显示其均存在差异甲基化基因改变。其中从孕早期血中成功筛选了11甲基化差异显著的基因,孕中期血中成功筛选了17甲基化差异显著的基因,孕晚期血中成功筛选了19甲基化差异显著的基因,其可能成为有效的预测指标。根据芯片位点信息及基因功能等,选取孕早期HOXA9、MTNR1A、PIWIL1进行下一步验证。第二章PE母体外周血中HOXA9、MTNR1A、PIWIL1的验证及其用于PE早期预测的研究[目的]从孕早期甲基化芯片筛选的甲基化差异显著的基因中挑选出HOXA9、MTNR1A、PIWIL1共3个候选基因,以焦磷酸测序检验在早发型PE组、晚发型PE组、正常对照孕妇组(对照组)中对应DNA位点的甲基化变化情况,并以RT-qPCR检测各候选基因的mRNA变化情况。探讨这些指标作为PE早期预测的可行性。[方法]研究对象为2012年10月-2013年11月期间在南方医科大学附属深圳妇幼保健院从孕早期建立妊娠期保健手册开始定期产前检查,并最终在本院分娩的孕妇。分为早发型PE组、晚发型PE组、对照组三组。排除各种合并症和妊娠并发症之后随机抽样每组10例,提取孕早期及分娩期(孕晚期)母体外周血DNA和RNA。焦磷酸测序检测MTNR1A、HOXA9及PIWILl三个筛选的目标基因在早发型PE组、晚发型PE组和对照组不同时期外周血的甲基化程度；RT-qPCR检测目标基因在各组的mRNA的表达情况。[结果]1.孕早期焦磷酸测序检验结果显示：(1)HOXA9在早发型PE组甲基化率(4.60±0.88%)显著高于晚发型PE组(1.30±0.73%)和对照组(1.44±0.70%)(P<0.05),余组间比较无统计差异(P>0.05);(2)MINR1A的两个位点在早发型PE组甲基化率显著高于对照组(P<0.05),余组间比较无统计差异(P>0.05)；(3)PIWILl在各组间的高甲基化无统计学差异(P>0.05)。2.孕晚期焦磷酸测序检验结果显示：(1)HOXA9在各组间未见统计学差异(P>0.05);(2)MINR1A两位点在早发型PE组及晚发型PE组均表现出高甲基化；MTNR1A(1)早发型PE组及晚发型PE组甲基化率与对照组差异有统计学意义(P<0.05); MTNR1A(2)甲基化率组间无统计学差异(P>0.05);(3) PIWIL1在三组间的高甲基化率差异无统计学差异(P>0.05)。3.孕早期HOXA9mRNA的RT-qPCR结果显示其早发型PE组相对量为0.56±0.08,为晚发型PE组的0.70倍及对照组的0.56倍；而MTNRIA mRNA及PIWIL1mRNA在外周血中未检测到。4.孕晚期HOXA9mRNA的RT-qPCR结果显示其早发型PE组相对表达量为0.77±0.07,为晚发型PE组的0.94倍及对照组的0.77倍；而MTNRIA mRNA及PIWIL1mRNA在外周血中未检测到。5.外周血中HOXA9mRNA相对表达量在早发型PE组、晚发型PE组、对照组孕晚期的表达量较孕早期均有增加。[小结]经焦磷酸测序检验和RT-qPCR验证,不同类型PE外周血HOXA9及MTNR1A在不同孕期甲基化程度存在差异,提示其可能与PE的发病及病理过程有关；此种母体外周血中HOXA9及MTNRIA甲基化差异可作为潜在的早发型PE早期预测指标之一。全文小结1.成功运用人全基因组DNA甲基化芯片(illumina450k)分析了早发型PE、晚发型PE及正常妊娠女性的孕早、中、晚期母体外周血的DNA甲基化差异。2.在孕早、中、晚期,与对照组比较,早发型PE和晚发型PE母体外周血中均存在甲基化差异表达基因,这些基因涉及细胞发育与增殖、血管生成、胎盘及胚胎的发育等,因此推测这些差异甲基化基因参与了PE的发生、发展。3.HOXA9在早发型PE孕早期母体外周血中DNA甲基化水平高于晚发型PE组及对照组(P<0.05),其mRNA表达亦降低,提示其有望成为早发型PE早期无创性预测指标。4.MINR1A两位点在PE母体外周血中呈高甲基化；在孕早期母体外周血中两个位点甲基化率早发型PE组与对照组间有统计学差异(P<0.05)；在孕晚期母体外周血中MTNR1A(1)早发型PE组、晚发型PE组甲基化率与对照组差异有统计学意义(P<0.05),提示其可能作为早发型PE的早期预测指标。5.孕妇外周血甲基化差异基因检测可作为预测PE发生的方法进行深入研究。