烟草黑胫病拮抗菌ZY-11-2的筛选、鉴定及其生物防治效果研究

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近年来,为响应我国绿色农业的号召,避免大量使用化学农药造成的“3R”问题,发挥持续防治、保护生态环境以及对人畜低毒安全等优势,生物防治方法在植物病害治理的舞台上扮演着越来越重要的角色,尤其是各类拮抗菌的筛选、代谢产物及衍生物抑菌活性研究和生产工艺优化,已成为当前的研究热点。  本研究为了发掘出抗烟草黑胫病菌(Phytophtora parasitica var.nicotianae)的拮抗菌,为病害的防治供给优良资源。从秦岭不同生态环境中采集30份土样,经过稀释涂布、划线培养、烟草黑胫病菌定向初筛、牛津杯法复筛、多种病原菌平板对峙后得到一株对烟草黑胫病菌有明显拮抗活性且具有良好广谱抑菌能力的拮抗菌ZY-11,其无菌发酵滤液对烟草黑胫病菌的抑菌带宽度为12.62±0.37mm。随后,利用传统形态学观察、生理生化特征测定结合16S rDNA基因序列分析对ZY-11菌株进行鉴定。结果显示ZY-11菌株的形态学及生理生化特征与芽孢杆菌模式菌株的特征基本吻合。通过16S rDNA基因序列分析,鉴定ZY-11菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。经检验,ZY-11菌株具有一定的溶血性,可能会对人畜健康造成未知的伤害,因此为了提高ZY-11菌株的安全性,对其进行物理(UV)和化学(DES)诱变。其中经UV诱变2、4min,DES诱变20min时各有一株弱溶血性突变菌株出现,分别命名为ZY-11-1、ZY-11-2和ZY-11-3。经检验ZY-11-2对烟草黑胫病菌的抑菌带宽可达11.59±0.51mm,与原始菌株ZY-11的抑菌带宽差异不显著,效果最佳,且转接7代,其弱溶血性可稳定遗传。接着,利用单因素控制法和多因素正交分析,得到ZY-11-2菌株液体发酵培养基各组分最佳配比为:玉米粉10.0g/L、豆粕10.0g/L、NaCl2.5g/L和K2HPO43.5g/L;最适培养条件:pH值为7.0,培养温度为32℃,接种量为6%-8%,装液量为30mL/250mL,转速为180r/min,培养时间为36h。检测发现发酵条件优化后ZY-11-2发酵液的OD600值、活菌数以及无菌滤液的防效均优于原始发酵液,说明优化效果明显。最后,对ZY-11-2菌株进行了防治效果的探究,温室盆栽试验中ZY-11-2发酵液(107cfu/mL)对烟草黑胫病的保护作用和治疗作用可达74.19%和58.34%左右。大田试验中ZY-11-2发酵液(107cfu/mL)在最后一次施药15d和30d时对烟草黑胫病的防治效果分别为:47.31%和41.03%左右。试验结果表示,ZY-11-2菌株可有效控制烟草黑胫病的发生和蔓延,具有一定的应用潜能。
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