以gp41为靶点的HIV-1融合抑制剂体外筛选方法研究

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获得性免疫缺陷综合征(艾滋病,AIDS)主要是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染而引起的一种重大传染病。目前尚没有可治愈艾滋病的特效药物和有效预防艾滋病的疫苗,因此研发高效低毒的抗HIV-1药物非常迫切。干扰HIV-1进入宿主细胞的抑制剂能在病毒进入宿主细胞之前阻断病毒感染,被认为是最有吸引力的抗HW-1药物靶点之一。HIV-1跨膜糖蛋白gp41是HIV-1包膜与宿主细胞膜融合过程中的关键蛋白,是理想的HIV-1融合抑制剂作用靶点。HIV-1 gp41蛋白的N端七残基重复序列(NHR)与C端七残基重复序列(CHR)可形成稳定的六螺旋束结构,这一结构有助于膜融合的发生。目前,美国FDA批准的以gp41为靶点的抗HIV-1药物仅有多肽类药物T-20一种。该药物成本较高且不能口服,所以研发可以口服的小分子融合抑制剂受到人们的关注。因此,以HW-1 gp41为靶点的药物设计和筛选具有十分重要的科学意义和应用价值。   本论文的主要研究内容和创新点如下:   (1)HIV-1 gp415-helix和6-helix重组蛋白的表达、纯化与功能鉴定   以含有HW-1 HXB2CG株全基因序列的pHIV质粒为模板,按照“SOE-酶切-连接”的路线逐段搭建获得全长目的基因。将HIV-1 gp415-helix和6-helix全长基因克隆入表达载体pET-28a(+),得到5-helix和6-helix重组表达载体p5-helix和p6-helix。将p5-helix和p6-helix分别转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),进行原核表达。诱导后的培养物经过尿素变性、稀释复性和亲和层析等步骤,纯化得到HIV-1 gp415-helix和6-helix重组蛋白。用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)实验发现,5-helix重组蛋白可与CHR衍生多肽T-20及C34发生特异性相互作用,可用于基于5-helix的融合抑制剂筛选方法研究。   (2)直接包被式HIV-1融合抑制剂体外筛选方法的建立与应用   HIV-1 g0415-helix表面暴露出来的CHR衍生多肽结合部位是本研究中融合抑制剂体外筛选方法建立的基础,与这一靶位结合的化合物分子可以抑制5-helix与CHR衍生多肽(本研究使用的是C34多肽)形成六螺旋束结构,从而抑制HIV-1与宿主细胞膜的融合。将HIV-1 gp415-helix重组蛋白直接包被子微孔板上,建立了直接包被式HIV-1融合抑制剂筛选方法。结果表明,本筛选方法的各项评价指标符合良好筛选方法的标准。用基于亲和前沿色谱.质谱联用技术的筛选方法对同一批样品进行筛选比较,与直接包被式筛选方法得到的筛选结果一致,验证了本筛选方法的可靠性。应用这一方法对一系列NB-2类似物等样品进行了筛选。   (3)磁珠式HIV-1融合抑制剂体外筛选方法的建立和应用   用可吸附组氨酸标签的Dynabeads(R)TALON(R)磁珠对含有HIV-1 gp415-helix重组蛋白的粗提物在微孔板上进行选择性包被,将原本独立进行的5-helix重组蛋白纯化与融合抑制剂筛选两个过程有机整合起来,达到了简化步骤、缩短时间、降低成本的目的。结果表明,磁珠式HIV-1融合抑制剂体外筛选方法的各项评价指标符合良好筛选方法的标准,并且优于直接包被式筛选方法,具有更高的灵敏度和特异性,并且可靠性更强,可用于以gp41为靶点的HIV-1融合抑制剂高通量体外筛选。应用该筛选方法对天然产物提取物样品进行了筛选。   (4)基因工程中两种常用技术的改进   对基因工程中常用的DNA琼脂糖凝胶回收电泳和菌液样品分布两种基本实验技术进行了改进。用小孔加样方式代替大孔加样方式对待回收的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,可以获得更为清晰锐利、分布面积更小的目的DNA条带。这使得切胶操作更为精准,而且切胶后的胶块体积也大为减少,在提高DNA回收质量的同时也节省了胶回收试剂。用喷雾法对菌液样品进行均匀分布,是对传统涂布法的重要改进。与涂布法相比,喷雾法的优势是省去了涂布棒的灼烧灭菌和手工涂布操作,一喷即可,提高了实验效率,具有一定的推广价值。以上技术改进已申请发明专利。   综上所述,本研究表达纯化了HIV-1 gp415-helix和6-helix重组蛋白,建立了直接包被式与磁珠式HIV-1融合抑制剂筛选方法,并应用这些筛选方法进行了融合抑制剂筛选和活性测试。
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