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1.前言：心肌梗死是危害人类健康的重大疾病,干细胞移植治疗是心肌组织修复最有前景的治疗手段之一,如何提高其修复疗效是关键问题。近年来很多研究证明移植后的干细胞主要通过旁分泌起作用,而其所分泌的外泌体(exosome)可能起到了主要的作用,将来利用干细胞分泌的exosome作为干细胞替代治疗是非常有前景的想法。预处理干细胞可以改善干细胞的生存能力,可能是通过改变细胞的表达谱来实现,同时细胞在各种不同的应激情况下其分泌的exosome亦有不同,而exosome中所携带的供体细胞来源的有益因子如蛋白质、microRNA等是发挥生物学作用的主要表现者,所以如何获得更有益的exosome来作为替代治疗是目前需要解决的问题。microRNA是一种长度大约在22个核苷酸的单链非编码RNA,通过抑制mRNA转录或促进mRNA降解来调节基因表达。其中microRNA-210是一种由HIF-1α调节的microRNA,我们发现,MSCs在缺氧条件下,miR-210的表达在细胞水平升高约10倍,并且其分泌的exosome中也增加了约25倍。然而预处理(如缺氧预处理)干细胞后是通过何种机制改变exosome表达谱至今未有报道。我们注意到Neutral sphingomyelinase Ⅱ (nSMase2)对exosome的释放以及蛋白质、microRNA等经exosome的装载有一定的影响。目前nSMase2对于间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)来源的exosome的形成以及exosome表达谱的影响至今未有报道。本研究着重探讨nSMase2在MSCs缺氧预处理(Hypoxia preconditioning, HP)后对于其exosome内microRNA表达谱的改变及其作用机制,为今后获得更有益的exosome来作为替代治疗提供新的思路。研究目的：研究缺氧预处理MSCs来源的exosome (exosomeHP)是否具有更佳的心梗后心脏保护作用,并探讨nSMase2在调节exosome中microRNA 210的作用机制。研究方法和结果：本研究首先比较了在常氧和缺氧条件下,MSCs分泌的exosome在数量和形态上的差异。通过BCA定量来比较总exosome的产量,结果显示常氧和缺氧下exosome的总蛋白含量无显著性差异,可以说明exosome释放的数量上没有差异；通过电镜来和Zetaszier Nano-S90仪器观察到常氧和缺氧来源的exosome在形态和粒径范围上也相似。我们进一步比较了两者的生物学效应,通过建立小鼠心梗模型,经心肌内注射分别来自于常氧和缺氧MSCs分泌的exosomes以及PBS,来观察不同处理后其对心梗后心肌修复的差异。体内实验分为四组：Sham组,PBS组,exosomecontrol组和exosomeHP组,观察了心梗后3、7、14、28天的小鼠心功能,发现exosomeHP组相比PBS组和exosomecontrol组心功能明显改善。通过体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)管腔形成试验和H9C2的凋亡试验,本研究同样得出exosomeHP组具有更明显的促血管形成和抗凋亡作用。通过qPCR检测发现exosomeHP中含有更高水平的miR-210,同时体外应用miR-210 mimic分别转染HUVECs和H9C2后也可观察到,与exosomeHP相似的促血管形成和抗凋亡生物学作用,表明miR-210在exosomeHP中的重要作用。进一步机制研究揭示,缺氧下的MSCs其nSMase 2的表达亦有所升高,并且可能是由HIF-1α调控。所以本研究通过加用nSMase 2抑制剂GW4869,观察到exosomeHP的促血管和抗凋亡作用被削弱了。研究发现经GW4869处理后缺氧MSCs分泌的exosome在总蛋白含量上没有统计学差异,而条件上清和exosome中的miR-210却降低了。研究结论：缺氧预处理MSCs来源的exosome具有更好的心梗后心脏保护作用,miR-210可能是其中发挥生物学作用的主要表现者,而nSMase2对于miR-210经exosome的释放起了重要的调控作用。