论文部分内容阅读
目的下丘脑腹外侧视前区(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)和结节乳头体核(tuberomammillary nucleus,TMN)分别是公认的促睡眠中枢和促觉醒中枢,两者以“此消彼长”相互制约的模式进行睡眠觉醒周期的调控。γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸是脑内参与睡眠觉醒调节的重要神经递质。为了进一步探究和阐述下丘脑腹外侧视前区-结节乳头体核调节睡眠觉醒周期的机制,本实验通过多导睡眠描记技术、脑立体定位微量注射技术、免疫组织化学等方法探讨VLPO-TMN对大鼠睡眠-觉醒周期的影响及其调节的受体通路。方法1.动物分组:根据实验总体设计,大鼠用于三个部分:1.1多导睡眠描记与分析:大鼠随机分成对照组[VLPO和TMN内均微量注射人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF),即VLPO+ACSF&TMN+ACSF组]和实验组Ⅰ(VLPO微量注射L-Glu同时TMN微量注射ACSF,即VLPO+L-Glu&TMN+ACSF组)、实验组Ⅱ(VLPO微量注射L-Glu同时TMN微量注射Bic,即VLPO+L-Glu&TMN+Bic组)。1.2检测VLPO区域代谢型谷氨酸受体以及TMN核团GABAA受体表达。1.3观察兴奋VLPO神经元后TMN区域c-Fos表达量的变化:大鼠随机分成对照组(VLPO微量注射ACSF,即VLPO+ACSF组)和实验组(VLPO微量注射L-Glu,即VLPO+L-Glu组)。术前准备好所需试剂以及仪器设备。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后将其头部固定于脑立体定位仪上,暴露颅骨,根据大鼠脑定位图谱把两根不锈钢中空引导管插入VLPO(AP:-0.36 mm;R:1.30 mm;H:-7.00 mm)及TMN(AP:-3.96 mm;R:1.50mm;H:-7.70mm)用于核团内给药,用牙科粘固粉将中空引导管和记录电极固定于大鼠颅骨表面,再把引导脑电与肌电的电极用细铜线和微型插座相连接(上述操作步骤用于建立多导睡眠描记模型,观察大鼠c-Fos表达变化的大鼠模型建立只需向VLPO内插入一根不锈钢中空引导管用于微量给药,同时省去上述电极与微型插座的操作),然后给予大鼠一定剂量抗生素(青霉素),缝合创口,最后放入隔音室中饲养,保证饮水和食物充足,并随时观察大鼠恢复状况。2.动物模型建立选取健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠,体重280-300 g。手3.微量注射给药用Hamilton微量注射器通过中空引导管向目的核团VLPO/TMN注射药物或ACSF,注射速度为1ml/min,给药完成将注射器停留1min防止药液渗出。给药时间为22:00-22:20(睡眠描记)和20:00-20:20(c-Fos表达量变化观察)。4.多导睡眠描记分析数据记录从给药前2小时(20:00)开始,记录时间为24小时。10秒为一个分段周期,将大鼠的睡眠觉醒周期分成:(1)觉醒期(wakefulness,W);(2)快动眼睡眠期(rapid eye movement,REM);(3)非快动眼睡眠期(non-rapid eye movement,NREM);REM睡眠和NREM睡眠总和定为总睡眠时间(total sleep time,TST)。5.取材大鼠经腹腔麻醉后,剪开胸腔并暴露心脏,持灌流针从心尖插入心脏经左心室至主动脉,迅速剪开右心耳,快速注入生理盐水约250ml,看到肝脏发白,再缓慢注入4%多聚甲醛约600ml,随后断头并用止血钳小心拨开颅骨取出脑组织。用刀片切成0.5cm左右厚度,最后放入4%多聚甲醛固定6h。6.免疫组化检测将包含目的核团的蜡块切成厚度为4um的切片,烤片后用二甲苯脱蜡梯度酒精水化,使用免疫组化试剂盒进行受体染色,最后在显微镜下观察染色情况。7.半定量分析TMN区域的c-Fos染色用累计光密度(integrated optical density,IOD)值反映蛋白表达水平。8.统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析,计量资料用均数±标准误(`x±s)表示,组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及t检验。检验水准P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.VLPO微量注射ACSF/L-Glu与TMN微量注射ACSF/Bic对大鼠脑电活动的影响1.1与对照组VLPO+ACSF&TMN+ACSF组(n=8)相比,VLPO+L-Glu&TMN+ACSF组(n=7)大鼠VLPO内微量注射L-Glu后从第二个小时起的两个小时内,其觉醒减少42.2%(38.13±3.17,P<0.01),非快动眼睡眠(NREM)与总睡眠时间(TST)分别增加了89.5%(52.90±2.98,P<0.01)、80.5%(69.33±3.63,P<0.01),快动眼睡眠(REM)无显著变化,差异无统计学意义;1.2与VLPO+L-Glu&TMN+ACSF组(n=7)相比,VLPO+L-Glu&TMN+Bic组(n=8)中GABA受体阻断剂Bic和L-Glu分别相继微量注射于TMN和VLPO,给药后的第二、三个小时内大鼠的觉醒量增加了81.1%(66.12±3.26,P<0.01),REM睡眠和NREM睡眠以及TST分别减少了58.9%(4.94±1.02,P<0.05)、50.2%(39.62±2.93,P<0.01)、56.1%(47.11±4.14,P<0.01)。1.3与VLPO+ACSF&TMN+ACSF组比较,VLPO+L-Glu&TMN+Bic组的大鼠睡眠觉醒状况未发生显著变化,差异无统计学意义。2.免疫组化结果2.1 m Glu R5在VLPO区域的表达与用PBS代替一抗的空白对照相比,m Glu R5在VLPO区域阳性表达明显,呈现棕黄色的强染色,定位于胞质膜,核呈蓝色,细胞容易辨认,结构清晰,阳性对照表达良好。2.2 GABAARβ1在TMN区域的表达与用PBS代替一抗的空白对照相比,TMN区域的GABAARβ1为棕色或棕黄色阳性表达,定位于细胞膜,核呈蓝色,细胞容易辨认,结构清晰,阳性对照表达良好。3.激动VLPO后TMN区域c-Fos蛋白表达的变化与对照组(53.98±2.02)相比,在VLPO脑区微量注射L-Glu后,检测到大鼠的TMN区域c-Fos表达量(21.82±1.22)明显减少,IOD值差异有统计学意义,软件分析t=11.10(P<0.01)。结论存在于VLPO和TMN的代谢型谷氨酸受体及γ-氨基丁酸受体介导VLPO-TMN的通路调节,VLPO可通过GABAAR抑制TMN神经元活动。