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研究背景：肝硬化是严重危害人类健康的常见病之一,临床上尚无特效的治疗手段。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)治疗被认为是较有希望的新疗法,多个国家探索性地应用MSC移植治疗肝硬化,Ⅰ、Ⅱ期临床研究结果也非常令人鼓舞。多项研究结果显示肝硬化患者经外周静脉或门静脉输注MSC后,患者的肝功能好转,主要体现在胆红素、血清白蛋白以及MELD评分的改善,但具体机制尚不十分清楚。有观点认为可能与MSC直接分化为肝细胞或/和旁分泌途径有关。近来的研究发现,MSC经门静脉移植后在受损肝脏中定植率仅2-5%,仅极少数分化为功能性肝细胞,部分MSC通过与肝细胞融合而整合到肝脏。因此,MSC通过分化为肝细胞而起到治疗作用的观点受到质疑,MSC的旁分泌功能日益受到重视。有学者通过向肝损伤小鼠体内分别输注MSC和MSC条件培养液(Mesenchymal stem cell-conditioned medium, MSC-CM)发现两组的治疗效果无显著差别,证明MSC的治疗作用主要通过旁分泌功能而实现。在肝脏损伤环境中,MSC可以分泌不同水平的细胞因子及生长因子,表现出抗炎、促增殖等多种生物学作用,并能激活肝内的肝干细胞,促进肝细胞再生。进一步的研究发现MSC分泌的多种细胞因子、生长因子可以参与调节细胞的凋亡、增殖、炎症反应等生理过程,但其对肝纤维化的影响及其机制尚不十分清楚。肝纤维化是肝硬化发展的必经阶段,而肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)激活又是肝纤维化的中枢事件。激活的HSC过度分泌胶原蛋白,造成细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)大量增生沉积,最终导致肝纤维化和肝硬化。而抑制HSC活化,减少活化的HSC数量能有效缓解肝纤维化的发生发展。因此,诱导和促进活化的HSC凋亡是治疗肝纤维化的策略之一。研究目的：为进一步了解MSC的旁分泌物质对肝纤维化的作用,本实验以活化的肝星状细胞系Lx-2为研究对象,通过MSC与Lx-2Transwell共培养,了解培养上清中MSC旁分泌物质对Lx-2的影响并探讨其机制。研究方法：采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell, BM-MSC),并将其与人肝星状细胞系Lx-2Transwell共培养组作为实验组,单独培养的Lx-2作为对照组,研究各组中MSC旁分泌物质对Lx-2的作用。采用流式细胞术及Hoechst33342染色法分别检测Lx-2细胞凋亡的情况,qRT-PCR和Western Blot检测Lx-2中解耦联蛋白2(Uncoupling protein2, UCP2)的mRNA和蛋白水平的表达量,荧光探针法检测Lx-2细胞内及线粒体中活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的荧光强度,脂质过氧化物试剂盒检测细胞培养上清中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的含量。研究结果：1、流式细胞术和Hoechst33342染色法示：与对照组相比,实验组Lx-2细胞凋亡增多,可见染色质固缩、颗粒状荧光等凋亡细胞典型表现,凋亡率是对照组的2.6倍,两组差异具有统计学意义；2、qRT-PCR和Western Blot检测示：实验组Lx-2中UCP2的蛋白表达量降低,对照组UCP2mRNA的表达量是实验组的2.16倍,两组相比P值小于0.05；3、细胞免疫荧光和脂质过氧化物检测示：实验组Lx-2细胞内和线粒体中ROS水平明显升高,细胞培养上清中MDA的含量是对照组的2.5倍左右,两组相比P值小于0.05。结论：1、MSC旁分泌物质有诱导Lx-2细胞凋亡的作用；2、此作用可能与MSC旁分泌物质抑制UCP2的表达,促进细胞内及线粒体ROS过量生成有关。