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恶性胶质瘤浸润性生长、易复发的特点及血脑屏障极大地限制了传统肿瘤治疗手段疗效的发挥。肿瘤肽疫苗依赖免疫系统,诱导机体产生特异性应答反应,进而靶向特异地杀伤肿瘤细胞,具有对正常细胞损伤小、特异性高、相对安全等优点,因此受到广泛关注。表皮生长因子受体突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)仅在恶性肿瘤细胞表面表达,并且在恶性胶质母细胞瘤中的阳性率高达约30%。EGFRvⅢ是由于EGFR2-7外显子区域的非移码缺失所形成的,在EGFRvⅢ的胞外段形成了一段含有13个氨基酸的特异性小肽片段,其氨基酸序列为:LEEKKGNYVVTDH,该小肽被命名为PEP3。目前研究表明,PEP3小肽可以作为一种潜在的肿瘤小肽疫苗,用于恶性胶质瘤的免疫治疗。小肽的免疫原性及拷贝数是影响免疫效果的重要因素。通常化学合成的小肽在机体内容易降解,而且免疫原性弱,因此,选择一种免疫载体以提高肿瘤抗原小肽的免疫原性及呈递拷贝数具有重要的意义。目前常用的免疫载体有病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)及病毒载体等。180或240个乙肝病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein,HBc)单体可自行组装成二十面体的病毒样颗粒结构,这种结构自身具有很强的免疫原性。在HBc-VLPs表面突起顶端的免疫显性区域插入外源小肽序列,可以将外源小肽呈现在病毒样颗粒的表面,进而针对小肽诱发较好的体液或细胞免疫反应。因此,HBc-VLPs可以作为抗原表位小肽PEP3的免疫载体,增强小肽疫苗的免疫效果。此外,腺病毒也是一种常用的疫苗载体,腺病毒衣壳表面具有240个六邻体蛋白(Hexon),在Hexon的HVR5区插入外源小肽,可将外源小肽展现在病毒颗粒表面。将PEP3小肽嵌合至腺病毒Hexon的HVR5区,不仅可以将高拷贝的PEP3小肽呈现在腺病毒颗粒表面,而且可以诱发针对PEP3小肽的免疫应答。综上所述,本课题通过借助腺病毒载体设计不同类别的PEP3小肽肿瘤疫苗,然后通过动物肿瘤模型评估这些肿瘤疫苗对恶性胶质瘤的治疗效果,从而为恶性胶质瘤疫苗的设计及其免疫治疗方案的选择提供理论支持。本课题的具体研究内容包括以下两方面:1.携带PEP3小肽重组腺病毒的构建、制备及纯化(1)E1区表达HBc-PEP3融合蛋白的腺病毒的制备与纯化:通过分子克隆手段,将HBc-PEPH基因片段连入腺病毒E1区穿梭载体pAd5-E1-CMV-MSC,从而获得E1区携带HBc-PEP3基因的穿梭载体pAd5-E1-CMV-HBc-PEP3;将其与实验室的腺病毒通用骨架载体pAd5-E3-CMV-eGFP backbone通过Pac Ⅰ线性化后共转染HEK 293细胞,包装后进行扩增,最后采用氯化铯(CsCl)密度梯度离心法纯化获得相应的腺病毒,命名为Ad5.E1-CMV-HBc-PEP3/E3-CMV-eGFP,编号为 9Z1。(2)Hexon区嵌合PEP3小肽的腺病毒的制备与纯化:通过分子克隆手段,将PEP3基因插入的腺病毒骨架载体pAd5-HVR5-MSC/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP的HVR5区,从而获得Hexon 区嵌合 PEP3 的腺病毒载体 pAd5-HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,Pac I 线性化后转染HEK 293细胞,包装后扩增,最后采用CsCl密度梯度离心法纯化获得相应的腺病毒,命名为 Ad5.HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,编号 9Z2。(3)E1区表达HBc-PEP3,且Hexon区嵌合PEP3小肽的腺病毒的制备与纯化:将上述获得的 E1 穿梭载体 pAd5-E1-CMV-HBc-PEP3,和骨架载体 pAd5-HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,通过同源重组获得腺病毒载体 pAd5-E1-CMV-HBc-PEP3/HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,PacI线性化后转染HEK 293 细胞,随后包装扩增,最后采用CsCl密度梯度离心法纯化获得相应的腺病毒,命名为Ad5.E1-CMV-HBc-PEP3/HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,编号 9Z3。(4)E1区表达并分泌HBc-PEP3的腺病毒的制备与纯化:通过分子克隆手段将HBc-PEP3基因插入E1区穿梭载体pAd5-E1-CMV-H1H2-MCS,获得重组质粒pAd5-E1-CMV-H1H2-HBc-PEP3,其将与实验室的腺病毒通用骨架载体pAd5-E3-CMV-eGFP backbone,通过PacI线性化后共转染HEK 293细胞,包装后进行扩增,最后采用CsCl密度梯度离心法纯化获得相应的腺病毒,命名为 Ad5.E1-CMV-H1 H2-HBc-PEP3/E3-CMV-eGFP,编号为 11H1。(5)E1区表达并分泌HBc-PEP3,且Hexon区嵌合PEP3小肽的腺病毒的制备与纯化:E1区穿梭载体 pAd5-E1-CMV-H1H2-HBc-PEP3,和骨架载体 pAd5-HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP 进行同源重组,获得的腺病毒载体 pAd5-E1-CMV-H1H2-HBc-PEP3/HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,经 PacI 线性化后转染 HEK 293 细胞,包装后进行扩增,最后用CsC1密度梯度离心法纯化获得相应的腺病毒,命名为Ad5.E1-CMV-H1H2-HBc-PEP3/HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,编号为 11G1。2.基于腺病毒载体的PEP3肿瘤疫苗在恶性胶质瘤动物模型中的实验治疗研究(1)五株腺病毒在动物体内免疫效果的评估:采用正常昆明鼠,肌肉注射腺病毒,共免疫三次,每次免疫间隔时间为2周,每次免疫剂量为2×1010vp/只,通过ELISA评估每次免疫后动物体内抗体的产生情况。(2)五株腺病毒对恶性胶质瘤荷瘤小鼠治疗效果的研究:在每只接种了腺病毒的小鼠右侧后肢皮下接种l×1O6个肿瘤细胞。通过测量肿瘤的长、短径,绘制小鼠荷瘤后20天内肿瘤的生长曲线,以此评估肿瘤疫苗对肿瘤生长的影响。本研究所取得的结果如下:1.成功获得五株携带PEP3小肽的腺病毒,分别为:Ad5.E1-CMV-HBc-PEP3/E3-CMV-eGFP,滴度为 1.9×1O12vp/mL;Ad5.HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,滴度为1.1×1012 vp/mL;Ad5.E1-CMV-HBc-PEP3/HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,滴度为2.6×1012vp/mL;Ad5.E1-CMV-H1H2-HBc-PEP3/E3-CMV-eGFP,滴度为 1.5×1012vp/mL;Ad5.E1-CMV-H1H2-HBc-PEP3/HVR5-PEP3/E3-CMV-luciferase-T2A-eGFP,滴度为 1.6× 1012 vp/mL。2.三次免疫后,各组动物体内都可以检测到针对PEP3小肽的抗体,但各株疫苗所诱发产生的抗体水平存在差异。其中表达并分泌HBc-PEP3,并且Hexon区嵌合PEP3小肽的重组腺病毒刺激产生的抗体水平明显高于其他组。3.各株重组腺病毒的预先免疫对恶性胶质瘤的生长都具有一定的抑制作用,其中:表达并分泌HBc-PEP3,并且Hexon区嵌合PEP3小肽的腺病毒对肿瘤生长的抑制效果最明显,仅表达HBc-PEP3的重组腺病毒对肿瘤生长的抑制作用则最弱。综上所述,本研究设计并获得了五株携带PEP3小肽的重组腺病毒。这些腺病毒不仅可以诱发机体的体液免疫应答,产生针对PEP3的抗体,同时对动物体内恶性胶质瘤的生长具有抑制作用。其中,表达并分泌HBc-PEP3、并且Hexon区嵌合PEP3小肽的重组腺病毒的免疫及治疗效果最好。该结果为进一步探究PEP3小肽疫苗在恶性胶质瘤的免疫治疗及临床治疗研究奠定了基础。