罗非鱼是中国重要的水产养殖品种,在中国南方地区广泛养殖,目前已经成为中国南方地区水产养殖的支柱产业之一。然而近年来中国罗非鱼链球菌病连年暴发,给罗非鱼养殖产业造成巨大的经济损失。无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是罗非鱼链球菌病的主要病原,传统的抗生素药物防控罗非鱼链球菌病的方法面临细菌耐药性、养殖环境污染和药物残留等诸多问题。如何科学的防控罗非鱼链球菌病的暴发,成为罗非鱼养殖产业亟待解决的关键问题之一。本研究分离纯化了2007-2016年中国南方地区罗非鱼源无乳链球菌300株,通过分子生物学方法对其进行分子分型;测定了77株甲醛灭活无乳链球菌与WC1535菌株兔抗血清的凝集效价;同时对169株代表菌株进行24种抗生素的药物敏感性测定,并对代表菌株检测了10种可能存在的耐药基因。主要的研究内容与结论如下:1中国罗非鱼源无乳链球菌分子流行病学研究提取300株罗非鱼源无乳链球菌基因组DNA,通过PCR方法进行了分子血清型、多位点序列分型(MLST)、前噬菌体基因型分型、菌毛岛屿分型和毒力基因的检测。结果显示,300株罗非鱼源无乳链球菌可以分为3种基因型:Ⅰb-ST-261型、Ⅰa-ST-7-A亚型和Ⅰa-ST-7-B亚型。Ⅰb-ST-261型菌株是Ⅰb血清型,ST型为261型,毒力基因为V2型,不携带本研究所检测的前噬菌体基因,不存在完整的菌毛岛屿,仅在中国南方局部地区短时间内流行。Ⅰa-ST-7型菌株血清型为Ⅰa,ST型为7型,毒力基因为V1型,是中国罗非鱼源无乳链球菌的主要流行菌株,流行时间长,分布广泛,该型菌株又可分为两种亚型:Ia-ST-7-A亚型的前噬菌体基因型为Phage-1,菌毛岛屿为PI-2b型,该亚型菌株主要在2007-2011年流行;Ia-ST7-B亚型的前噬菌体基因型为Phage-2,菌毛岛屿为PI-1+PI-2b型,该亚型菌株在2010年首次出现,2011-2016年成为广泛流行株型,是Ⅰa-ST-7型无乳链球菌中最主要的流行菌株,由此推测中国罗非鱼源无乳链球菌流行菌株亚型在2010-2011年发生了遗传转变。2中国罗非鱼源无乳链球菌血清抗体凝集效价测定本实验选取了2007-2016年各地区的罗非鱼源无乳链球菌代表菌株77株,活化培养后用甲醛处理制成灭活菌体抗原。通过96孔酶标板倍倍稀释法测定灭活菌体抗原与无乳链球菌WC1535菌株兔抗血清的凝集效价。结果显示:46株罗非鱼源无乳链球菌灭活菌体与血清抗体的凝集反应测定为阳性,占比59.7%,凝集效价为1:10240;阴性结果菌株31株,占比40.3%,最低血清抗体凝集效价为1:5。2007-2011年88%检测菌株为阴性,2012-2016年82.6%的检测菌株为阳性,由此推测中国罗非鱼源无乳链球菌的优势流行菌株在2011年发生了转变。3中国罗非鱼源无乳链球菌药物敏感性测定和耐药基因检测本实验采用药敏纸片法测定了169株罗非鱼源无乳链球菌的药物敏感性,实验结果显示,中国罗非鱼源无乳链球菌对多种药物具有耐药性,各流行时间的菌株之间耐药类型差异不明显。169株无乳链球菌对大环内酯类药物(罗红霉素、乙酰螺旋霉素)、β-内酰胺类药物(头孢氨苄、头孢噻吩、氨苄西林)、林可霉素、四环素类药物(四环素、强力霉素)、氧氟沙星、利福平、氯霉素与氟苯尼考等12种药物均敏感,敏感率达100%;对氨基糖苷类药物和磺胺类药物普遍耐药,耐药率大于85%,但是对壮观霉素的耐药率较低;对喹诺酮类药物的耐药性表现出很大的差异,对氧氟沙星和恩诺沙星的耐药率为0,对诺氟沙星的耐药率为14.2%,对洛美沙星的耐药率为82.8%,对依诺沙星的耐药率高达98.2%;没有发现青霉素耐药菌株。耐药谱的测定结果为罗非鱼源无乳链球菌的临床用药提供了科学依据。60株分离于2016年的无乳链球菌代表菌株的10种耐药基因的检测结果均为阴性,并没有检测到本研究中选取的耐药基因,因此罗非鱼源无乳链球菌的耐药表型与耐药基因的关系需要进一步的研究。