论文部分内容阅读
本学位论文首先建立了镉(Cadmium,Cd)胁迫和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒斑马鱼(Danio rerio)的浓度模型。用不同浓度镉(0、2、4、6、8和10 mg/L)胁迫斑马鱼,观察96h之内出现的症状并统计死亡率。其次验证了嗜水气单胞菌的毒力基因,经鉴定合格后,通过腹腔注射斑马鱼50μL不同浓度的细菌(0、9.458×105、9.458×106、1.892×107、9.458×107和9.458×108 cfu/ml),观察7d之内的感染症状并统计死亡率。分析得到半致死浓度,建立镉胁迫及嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼模型。然后,探究了不同浓度镉(0、0.23和1.15 mg/L)处理斑马鱼后五种组织(肾脏、脾脏、肝脏、鳃和肠道)八个常用内参基因的表达变化;选取表达相对稳定的内参基因,继续评估它们在镉胁迫后腹腔注射嗜水气单胞菌12h和9d之后的表达情况。最后,为了探究急性镉胁迫前后斑马鱼对嗜水气单胞菌的免疫应答早期变化,根据以上结果设置了不同的镉浓度组(0、0.23、1.15和5.75mg/L)。处理96 h后每个浓度组斑马鱼随机分为两个亚组:分别注射PBS和嗜水气单胞菌,12 h后采用实时荧光相对定量PCR方法检测肾脏、脾脏和肝脏中早期炎性因子il-1β、il-6、il-8和tnf-α的mRNA表达水平。根据结果又进一步研究了对照组(0 mg/L)和最高浓度镉组(5.75 mg/L)处理96 h,注射细菌0、6、12、24和48 h之后早期炎性因子的应答变化。实验结果如下:1.建立了镉胁迫及嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼模型根据斑马鱼死亡情况并计算死亡率,分析得到急性镉胁迫斑马鱼96 h的半数致死浓度LC50为5.8 mg/L,嗜水气单胞菌感染斑马鱼7 d的半数致死剂量LD50为2.7×106 cfu。2.分析了镉胁迫及细菌感染斑马鱼后参比基因的稳定性镉胁迫后在五种组织中表达相对稳定的四个参照基因分别依次为:(1)肾脏:rplp2、rpl7、β-acti和ef1α;(2)脾脏:β-actin、gapdh、ef1α和rpl13α;(3)肝脏:rpl7、rpl13α、β-actin和ef1α;(4)鳃:rplp2、gapdh、rnf7和ef1α;(5)肠道:ef1α、rnf7、rplp2和rpl13α。镉胁迫后注射嗜水气单胞菌12h和9d之后:ef1α在肾脏和脾脏中,rpl13α在肝脏中,rplp2在肠道中相对来说表达最稳定。在鳃中,注射嗜水气单胞菌12 h后ef1α表达相对较为稳定,而9 d之后gapdh相对于ef1α更加稳定。3.探究了急性镉胁迫后斑马鱼免疫器官对嗜水气单胞菌的应答变化在不同浓度组,三种组织中注射嗜水气单胞菌的亚组内四个基因(il-1β、il-6、il-8和tnf-α)的mRNA表达水平均高于注射PBS的亚组,大多数都呈现显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)差异;在不同浓度组间,注射PBS的亚组之间没有明显差异,而注射嗜水气单胞菌后高镉浓度(5.75 mg/L)组的斑马鱼肾脏中il-1β(p<0.01)、il-6(p<0.01)和il-8(p<0.01)基因,脾脏和肝脏中il-1β(p<0.05)和il-8(p<0.01)基因相对于对照组中注射嗜水气单胞菌组出现了显著性上调。在嗜水气单胞菌感染过程中,对照组和高浓度镉处理组(5.75 mg/L),斑马鱼肾脏、脾脏和肝脏中四个基因的mRNA表达量均呈现先升后降的趋势。在注射嗜水气单胞菌后不同时间点:镉胁迫组(5.75 mg/L)肾脏中四个基因mRNA表达水平均高于相应的对照组,其中il-6基因在嗜水气单胞菌感染后6h和48h分别呈现显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异;il-8基因和tnf-α基因在嗜水气单胞菌感染后48 h呈现出极显著(p<0.01)异;脾脏中il-1β基因在细菌感染后Oh呈现显著(p<0.05)差异;肝脏中il-1β基因在细菌感染后0 h和48 h呈现极显著(p<0.01)差异;il-6、il-6、il-8和tnf-α基因在嗜水气单胞菌感染后48h呈现出显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)差异。综合以上研究结果,得出如下结论:1.急性镉胁迫和嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼,浓度越高,死亡现象出现越早,最终累计死亡率越大,表明两种胁迫因子对斑马鱼的致死率具有明显的浓度-效应关系。高浓度镉胁迫,引起斑马鱼鳃、腹部及尾部充血或出血;嗜水气单胞菌的毒力基因在体内大量表达,引起斑马鱼呼吸困难、腹部红肿甚至出血现象。2.急性镉胁迫和嗜水气单胞菌攻毒斑马鱼,不同组织内参基因的稳定性不同;不同实验条件内参基因的稳定性也不同。在涉及新的处理或刺激条件下,使用实时荧光相对定量qPCR方法,必须对参照基因进行稳定性评估。3.正常组和不同镉胁迫组,斑马鱼主要免疫器官肾脏和脾脏、解毒器官肝脏均对嗜水气单胞菌的感染做出应答,并且在感染过程中均呈现先升后降的趋势;但是,与对照组相比,高浓度镉胁迫增强了斑马鱼肾脏和肝脏中促炎因子对嗜水气单胞菌的应答。然而在脾脏中这种变化并不明显。