默克尔细胞联合雪旺氏细胞样细胞在足底皮肤创面触觉恢复中的作用研究

来源 :遵义医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:caoyufeiyu
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目的:通过体外对默克尔细胞(MCs)、雪旺氏细胞(SCs)、人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)诱导后的雪旺氏细胞样细胞(SCLCs)的分离、培养及鉴定,观察MCs与SCLCs联合移植在足底皮肤创面触觉恢复的作用。方法:1.无菌操作获取新生3天SD大鼠幼崽足底和须垫皮肤,采用中性蛋白酶和胰蛋白酶级联消化法分离提取MCs,培养6天后,细胞免疫荧光鉴定MCs,及Western Blot检测CK20和Piezo2蛋白的表达,ELISA测定不同时间CGRP分泌量。2.无菌操作获取新生3天SD大鼠幼崽坐骨神经,采用胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化分离提取SCs。细胞免疫荧光鉴定P3代SCs。3.采集足月剖宫产羊膜,采取胰蛋白酶和胶原酶级联消化法分离提取hAMSCs。细胞免疫荧光鉴别P3代hAMSCs。4.取P3代hAMSCs,在加入适当诱导因子,将hAMSCs诱导为SCLCs。分别取SCs和SCLCs做细胞免疫荧光检测 S-100、P75、GFAP表达,以及Western Blot检测S-100、P75、GFAP蛋白的表达。5.建立SD大鼠足底全层皮肤缺损模型,分为四组:假手术组(原皮肤切开)、模型组(生理盐水)、对照组(SCs联合MCs移植组)、实验组(SCLCs联合MCs移植组),每组10只;观察创面愈合情况;第0、7、10、14天行Von fren纤维测定缩足反射阈值;第0、7、14天行棉拭子缩足检测;提取愈合创面皮肤组织做Western Blot检测Piezo2、MBP的蛋白表达。结果:1.采用酶消化法可以得到原代MCs,培养至第6天,行细胞免疫染色鉴定,CK20和Piezo2高显色;Western Blot和qPCR的检测结果表明实验组比对照组表达水平明显升高(p<0.05);CGRP分泌量随时间增长而增加(p<0.05)。2.采用酶消化法可以得到原代SCs,培养至P3代后行细胞免疫荧光鉴定,S-100、P75、GFAP均高显色。3.采用酶消化法可以得到原代hAMSCs,培养至P3代后行细胞免疫荧光鉴别,结果hAMSCs组细胞vimentin高表达,CK19不表达。4.诱导后的SCLCs行细胞免疫荧光鉴定,SCLCs组的S-100、P75、GFAP均高显色,而hAMSCs组不显色;WB检测S-100、P75、GFAP蛋白相对表达量,结果示SCLCs组比hAMSCs组表达水平明显高(p<0.05)。5.四组创面愈合速度为假手术组<对照组≈实验组<模型组;在第0、7、14天做棉拭子缩足反应检测以及在第0、7、10、14天Vonfren纤维测定缩足反射阈值,所得结果为假手术组>对照组>实验组>模型组(p<0.05),具有统计学差异;Western Blot检测愈合创面皮肤组织的Piezo2、MBP的蛋白表达,发现模型组的这两种蛋白表达显著低于实验组和对照组,灰度定量后得(p<0.05),统计学差异明显。结论:SCLCs联合MCs能够促进皮肤创面触觉恢复。
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