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花生是世界八大类过敏食物之一,并且由于花生过敏反应具有长期性、普遍性、严重性等特点,已引起全球范围内的广泛关注。现阶段,人们已经发现了11种花生过敏原蛋白,其中Arah1蛋白含量最高,且被90％的花生过敏患者的血清所识别,是花生主要过敏原之一。因此,本文的主要研究工作围绕Arah1展开。
论文主要工作包括从花生种子中分离纯化天然过敏原Arah1、兔抗天然Arah1蛋白多克隆抗体的制备、Arah1基因的克隆、重组Arah1的原核表达与纯化。研究的主要方法与结论如下:
1.先后采用DEAE-SepharoseFastFlow阴离子交换层析、Superdex200凝胶层析及ConASepharoes4B亲和层析等三步分离纯化花生过敏原Arah1,并利用MALDI-TOF/MS对所分离的蛋白进行鉴定。结果表明,本方法可分离纯化得到纯度为90%以上的天然Arah1,提取得率为43毫克/10克花生。
2.以纯化的天然Arah1为抗原,免疫新西兰大白兔,获得兔抗Arah1多克隆抗体,通过ELISA和免疫印迹方法检测其效价和特异性,结果表明,该抗体效价达1:200,000,且不与花生中其他蛋白发生交叉反应,能够满足后续实验的需要。
3.利用SVTotalRNAIsolationSystem试剂盒从花生种子中提取花生总RNA,采用RT-PCR技术扩增获得花生过敏原Arah1基因,并将其克隆入pMD18-TSimpleVector载体,再导入E.coliDH5α克隆菌保存。对目的基因进行的序列测定表明,该基因与已报道的Arah1序列具有99%的同源性。
4.双酶切重组质粒pMD18-T-Arah1得到Arah1目的基因,连接至pET-32a表达载体中构建重组质粒pET-32a-Arah1,并将其转化到表达宿主菌BL21(DE3)plysS中,IPTG诱导表达出重组蛋白Arah1,并通过SDS-PAGE与免疫印迹实验进行验证。然后对表达宿主菌进行不同IPTG浓度、不同摇床转速、不同诱导温度和时间等条件的优化,获得重组蛋白Arah1可溶性表达的最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速160rpm,诱导温度24℃,诱导时间为8h。最后通过亲和纯化的方法获得重组蛋白Arah1。