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干扰素(Interferon,IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节等作用的细胞因子,能增强细胞毒性T细胞功能、促进B细胞分化、MHCⅠ和、MHCⅡ类分子的表达以及活化巨噬细胞。为研究猪γ干扰素(poIFN-γ)的生物学活性及其在机体免疫应答中的作用机理,本研究进行了该基因的克隆、表达和多克隆抗体的制备。首先,应用RT-PCR方法通过一对自行设计的引物从猪脾脏淋巴细胞中扩增了猪γ干扰素基因片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的猪IFN-γ基因序列含有相同的单酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pGEX-4T-1和pET-32a载体,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆后进行序列测定,测序结果表明,克隆获得的IFN-γ基因全长为516个碱基,ORF为501个碱基,编码166个氨基酸,分子质量约为17kD。此基因与GenBank上发表的猪IFN-γ基因的核苷酸同源性为100%,并且在氨基酸水平上也完全一致。其次,将重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ转化到大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,得到高效表达。所表达的融合蛋白主要是以不溶性的包涵体形式存在,分子量约43.0kD和35.0kD,与理论推算值相符。通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ的最佳诱导时间和诱导剂浓度后,对含有pGEX-poIFN-γ和pET-poIFN-γ质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,获得了较高浓度的GST-IFN-γ和His-IFN-γ包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-IFN-γ和His-IFN-γ原核融合表达蛋白。最后,利用上述纯化的GST-IFN-γ融合蛋白作为抗原免疫小鼠制备鼠抗猪IFN-γ多克隆抗体。在对目标蛋白进行复性和亲和层析纯化之后,用其免疫小鼠,制备了针对该蛋白的鼠多克隆抗体。ELISA和Western Blotting结果说明GST-IFN-γ融合蛋白可诱导出针对poIFN-γ蛋白的特异性抗体。综上所述,本研究成功地克隆了猪IFN-γ基因,构建原核表达质粒,进行了原核蛋白的表达并制备出了针对poIFN-γ蛋白的特异性抗体,为进一步研究猪IFN-γ重组蛋白的免疫学特性和生物学活性及其应用奠定基础。恒定链(invariant chain,Ii)是MHCⅡ类分子的伴侣蛋白,主要存在于人、哺乳动物和禽类的体细胞表面,如B淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、胸腺上皮细胞等。人类和小鼠的Ii基因都是单拷贝基因,其mRNA都能够以不同的拼接模式产生不同形式的Ii链异构体。Ii链可以辅助MHCⅡ类分子在内质网中进行正确折叠并迁移出内质网;提供MHCⅡ类分子进入内体/溶酶体的靶信号;阻止MHCⅡ类分子与内质网的内源性抗原结合。MHCⅡ-Ii复合体的内体分选信号已被证明为Ii链胞浆尾部的两个独立的亮氨酸基元,即Ii链胞浆尾部的Leu 7/Ile 8和Pro 15/Met 16/Leu 17。鸡Ii链及其异构体胞浆尾部也含有Leu 8/Ile 9和Gly 16/Val 17/Leu 18两个基元。为研究鸡恒定链P31基因的该基元是否具有内体定位功能,我们用两对引物通过PCR从PMDl8-T/Ii P31质粒中扩增出鸡Ii的P31基因,将该基因分别插入真核表达载体pEGFP-N1和pEGFP-C1中,构建成pEGFP-N1-P31和pEGFP-C1-P31质粒。将这两个质粒转染HEK 293细胞,经48h培养后用荧光显微镜检测。结果表明,重组质粒pEGFP-N1-P31和pEGFP-C1-P31转染的细胞荧光主要出现在胞浆区的细胞器内,而由pEGFP对照转染的细胞中绿色荧光则主要分布在胞核。这说明鸡Ii P31分子具有内体定位的作用。应用大引物PCR突变法,将鸡Ii链的第8位和第18位的Leu分别突变为Ala后,突变体的GFP都仍能定位于内体。进一步将鸡Ii链的第8位和第18位的Leu均突变为Ala后,鸡Ii链的内体定位功能消失,这表明鸡Ii链胞浆区存在Leu 8/Ile 9和Gly 16/Val 17/Leu 18两个独立的内体分选信号。