随着社会的发展,人们已逐渐关注到糖尿病、恶性肿瘤已成为威胁人类生命健康的全球性问题。近年来,越来越多的流行病学和临床资料显示,糖尿病患者易患恶性肿瘤。有研究发现,2型糖尿病发生恶性肿瘤时以消化道肿瘤占第一位。原发性肝癌是世界上最常见且恶性程度最高的消化道肿瘤之一,其发病率居世界恶性肿瘤第五位,死亡率居第三位。我国是肝癌的高发区之一,每年死于肝癌的人数占全世界肝癌死亡人数的50%以上。由于肝癌的高发病率和死亡率,关于其病因学与发病机制的研究已成为国内外学者关注的焦点。目前已知,乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染、嗜酒等与肝细胞性肝癌发生发展关系密切,但仍有部分肝癌的病因尚不明确。2型糖尿病与肝细胞性肝癌的发生发展是否存在相关性?其分子机制是什么?仍不十分清楚,而且目前关于两者关系的研究多局限于流行病学调查和临床病例对照研究方面,具体的实验研究还甚少,国内外相关研究报道资料也较少。依据2型糖尿病病理生理的改变,可将2型糖尿病的自然病程分为4个阶段,每个阶段均有葡萄糖、胰岛素水平的不同变化,血葡萄糖和胰岛素水平的变化贯穿于2型糖尿病的全过程。若2型糖尿病与肝细胞性肝癌有关,其自然病程中不同葡萄糖、胰岛素水平的变化是否对肝细胞肝癌的生物学特征产生影响?目前国内外相关研究报道资料较少,需要进一步对其进行研究。肝癌的发生和发展是一个多基因、多因素、多阶段的复杂演变过程,涉及到多种癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的细胞生物学行为的改变等。环氧合酶-2(COX-2)是一种诱生型酶,在大多数正常组织和细胞中不表达,而多参与炎症、肿瘤等病理过程,在80%的肿瘤标本中都存在有COX-2的高表达,COX-2可通过促癌基因的激活和／或抑癌基因失活,促细胞增殖和／或抑制细胞凋亡,促肿瘤血管生成,促肿瘤细胞侵袭、转移,使机体产生免疫耐受致监视能力降低等多方面作用促肿瘤发生发展。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种内皮细胞的特异性有丝分裂原,能够调节血管及淋巴管的生成,是目前已知作用最强、特异性最高的促血管生成因子。VEGF表达调控受多种因素的影响,且其异常表达与肿瘤及某些疾病的发生发展密切相关。肝癌是一种富血供实体肿瘤,生长快,易复发转移,其中血管生成环节在肿瘤的生长、侵袭、转移过程中起重要作用。所以本实验模拟2型糖尿病病程中不同葡萄糖、胰岛素浓度的变化环境,检测其对人肝癌SMMC-7721细胞体外生长的影响及对COX-2、VEGF基因表达的影响,初步探讨2型糖尿病与肝细胞性肝癌之间的关系,并为肝细胞性肝癌的临床防治工作提供新思路和理论依据。实验方法1.肝细胞性肝癌危险因素的病例对照研究选取于我院2006年1月～2011年12月期间住院的1350例肝细胞性肝癌患者(病例组)的病例资料和同期住院的1350例非肿瘤患者(对照组)的病例资料,对相关数据进行搜集、整理,采用x2检验比较两组一般人口学特征的差异和2型糖尿病与肝细胞性肝癌发病的相关性,Logistic回归分析评估肝细胞性肝癌危险因素的比值比(odds ratio, OR)及95%可信区间(95%confidence interval,95%CI)。2.实验用人肝癌SMMC-7721细胞培养浓度和时间的选择通过倒置显微镜下观察并结合MTT方法评价细胞生长状态和数量,以此确定实验用人肝癌SMMC-7721细胞最佳接种浓度和合适培养时间。3.不同浓度葡萄糖、胰岛素对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响应用MTT方法检测不同浓度葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)、胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml)及葡萄糖+胰岛素(5+10,5+100,20+100,20+10)对人肝癌SMMC-7721细胞作用48小时后的影响,通过检测细胞在492nm波长下的吸光度(A492值),分析细胞增殖能力。4.不同浓度葡萄糖、胰岛素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响使用流式细胞仪检测不同浓度葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)、胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml)及葡萄糖+胰岛素(5+10,5+100,20+100,20+10)对人肝癌SMMC-7721细胞作用48小时后细胞凋亡率的变化,分析细胞凋亡情况。5.不同浓度葡萄糖、胰岛素对人肝癌SMMC-7721细胞COX-2、VEGFmRNA表达的影响应用半定量RT-PCR法检测不同浓度葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)、胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml))及葡萄糖+胰岛素(5+10,5+100,20+100,20+10)条件下,各组人肝癌SMMC-7721细胞中COX-2、VEGFmRNA的表达情况。6.不同浓度葡萄糖、胰岛素对人肝癌SMMC-7721细胞COX-2、VEGF蛋白表达的影响应用VVestern Blot方法检测不同浓度葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)、胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml))及葡萄糖+胰岛素(5+10,5+100,20+100,20+10)条件下,各组人肝癌SMMC-7721细胞中COX-2、VEGF蛋白的表达情况。统计学分析采用SPSS16.0统计软件对所得数据进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,二分类变量采用x2检验,危险因素采用Logistic回归分析,多组间均数的比较采用方差分析。以a=0.05作为检验性水准。结果1.嗜酒、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、2型糖尿病和肝癌家族史为肝细胞性肝癌的发病危险因素(P<0.05),其中2型糖尿病可增加肝细胞性肝癌发病风险的比值比OR=1.881,95%CI:1.314-2.671;而嗜烟、肥胖与肝细胞性肝癌的发病无关(P>0.05)。2.为避免实验过程中人肝癌SMMC-7721细胞本身生长因素对实验结果的影响,我们摸索了实验用细胞接种的最佳浓度为2×105个/ml,细胞培养的合适时间为48小时。3.随着葡萄糖浓度(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)和胰岛素浓度(l0μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml)的提高,人肝癌SMMC-7721细胞增殖能力逐渐增强,其中100μIU/ml葡萄糖组的增殖能力最强(0.6564±0.054)；联合葡萄糖+胰岛素并未显示出对增殖能力的协同作用,其中20+100组细胞增殖能力较其他联合组(5+10,5+100,20+10)强(P<0.05)。4.随着葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)和胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml100IU/ml)浓度的提高,人肝癌SMMC-7721凋亡细胞的数量逐渐减少,其中以胰岛素100μIU/ml组的细胞凋亡率最低(7.54±0.9%)；联合组(5+10,5+100,20+100,20+10)细胞凋亡率并未显示协同作用,其中20+100组细胞凋亡率较其他联合组(5+10,5+100,20+10)低(P<0.05)。5.随着葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)浓度的升高,人肝癌SMMC-7721细胞中VEGF mRNA表达明显增高,其中20mmol/L组细胞中VEGF mRNA相对表达量为2.784±0.07,远高于其他组(P<0.05),而COX-2mRNA表达增高与VEGFmRNA增高并不一致,其中10mmol/L组COX-2mRNA表达最高,为0.57±0.05,高于其他组(P<0.05)。不同的是随着胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml)水平的升高,人肝癌SMMC-7721细胞中VEGF和COX-2mRNA表达量均明显增高,100μIU/ml组细胞VEGF和COX-2mRNA相对表达量分别为1.71±0.03和1.744±0.05,明显高于其他组P<0.05)。同时,联合组(5+10,5+100,20+100,20+10)中,20+100组细胞中VEGF mRNA相对表达量较其他组明显增高(P<0.05),但COX-2mRNA表达无明显变化。6.随着葡萄糖(5mmol/L,10mmol/L,20mmol/L)浓度的升高,VEGF蛋白表达明显增高,其中20mmol/L组细胞VEGF蛋白相对表达量为2.53±±0.11,远高于其他组(P<0.05),而COX-2蛋白表达增高与VEGF蛋白增高并不一致,其中10mmol/L组COX-2蛋白表达最高,为0.74±0.08,高于其他组(P<0.05)。随着胰岛素(10μIU/ml,50μIU/ml,100μIU/ml)浓度的升高,VEGF和COX-2蛋白表达量均明显增高,l00μIU/ml组细胞VEGF和COX-2蛋白相对表达量分别为2.05±0.14和0.92±0.15,明显高于其他组(P<0.05)。同时,联合组(5+10,5+100,20+100,20+10)中,20+100组细胞VEGF蛋白相对表达量较其他组明显增高,但COX-2表达无明显变化。结论1.2型糖尿病可增加肝细胞性肝癌的发病风险,其是肝细胞性肝癌发病的独立危险因素之一；2型糖尿病与肝细胞性肝癌的发病相关,且与嗜酒、乙肝和丙肝病毒感染之间存在协同作用。2.高浓度葡萄糖和胰岛素可以增加人肝癌SMMC-7721细胞的增殖能力和减少细胞凋亡,其中胰岛素的作用最为明显,且两者无明显协同作用。3.高浓度葡萄糖可以提高人肝癌SMMC-7721细胞中VEGF基因的表达,但不能提高COX-2基因表达；高浓度胰岛素不仅可以提高VEGF基因的表达,还可以提高COX-2基因表达；葡萄糖与胰岛素联合对两基因的表达无明显协同作用。