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褐飞虱Nilaparvata lugens(Stal)是我国重要的水稻害虫,造成严重的产量损失,并能远距离迁飞。近年来,由于全球气候的异常,水稻品种和稻田生态系统的变化,以及化肥、农药等大量施用,我国褐飞虱发生为害面积不断扩大。为了揭示褐飞虱灾变的内在机制,必须借助于现代分子生物学手段研究其生长发育的分子机理,开展功能基因组学研究。RNA干扰(RNA interference)技术是一种强有力的分子生物学手段,在昆虫的功能基因组学研究中得到了广泛应用。21E01是一个来自于褐飞虱均一化cDNA文库的一个全长cDNA克隆,其编码褐飞虱V-ATPase E。V-ATPase E位于昆虫胃肠道上皮细胞上,是一类特殊的膜转运结合蛋白,是多种昆虫体内原生质膜碱化和参与提供氨基酸等营养物质吸收所需能量。本研究利用基因特异引物,针对21E01不同位点,体外合成相对应的3条双链RNA(dsRNA)(ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01),并将dsRNA通过人工喂食的方法导入褐飞虱3龄若虫体内,利用qRT-PCR技术,测定了3条dsRNA对靶标基因表达的影响。结果如下:
(1)按照前人的方法,本研究成功配制了褐飞虱纯人工饲料。人工喂食结果表明:随着褐飞虱取食人工饲料时间的延长,褐飞虱的存活率逐渐降低,但累计存活率都在90％以上,为褐飞虱dsRNA喂食打下了基础。
(2)结果表明:在50 ng/μl的浓度下,3条dsRNA均可以诱导靶标基因的沉默。基因沉默的时间动态分析表明:ds2-21E01和ds3-21E01摄入后2天就明显抑制了靶标基因的表达,而ds1-21E0110天后才产生明显的抑制效果。dsRNA处理10天后,ds1-21E01, ds2-21E01, ds3-21E01对靶标基因的抑制效果最强,抑制率分别为41％,55％和48％。
(3)本研究调查了褐飞虱取食dsRNA2天、6天和10天时的死亡率,结果表明,取食ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01的褐飞虱死亡率与对照ds-GFP相比无显著性差异,即ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01对褐飞虱无致死作用。
(4)连续喂食ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01,直至褐飞虱若虫羽化,将雌雄成虫配对置于稻苗上产卵,待下一代卵孵化成若虫后,检测其体内21E01的表达量。结果表明:与取食ds-GFP成虫产生的后代相比,取食ds1-21E01的褐飞虱后代体内21E01基因表达量显著高于对照;取食ds2-21E01和ds3-21E01的褐飞虱后代体内21E01基因的表达量与对照之间无显著差异。这说明在本试验条件下,褐飞虱的RNA干涉是非系统性的,不能遗传给后代。本研究建立了一个基于dsRNA喂食的高效、操作便利的褐飞虱RNA干涉技术体系,这是首篇关于褐飞虱RNA干涉技术体系的研究。本技术将为褐飞虱功能基因组学提供有力工具,并为通过RNA干涉技术防治褐飞虱提供新的思路。
(1)按照前人的方法,本研究成功配制了褐飞虱纯人工饲料。人工喂食结果表明:随着褐飞虱取食人工饲料时间的延长,褐飞虱的存活率逐渐降低,但累计存活率都在90％以上,为褐飞虱dsRNA喂食打下了基础。
(2)结果表明:在50 ng/μl的浓度下,3条dsRNA均可以诱导靶标基因的沉默。基因沉默的时间动态分析表明:ds2-21E01和ds3-21E01摄入后2天就明显抑制了靶标基因的表达,而ds1-21E0110天后才产生明显的抑制效果。dsRNA处理10天后,ds1-21E01, ds2-21E01, ds3-21E01对靶标基因的抑制效果最强,抑制率分别为41％,55％和48％。
(3)本研究调查了褐飞虱取食dsRNA2天、6天和10天时的死亡率,结果表明,取食ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01的褐飞虱死亡率与对照ds-GFP相比无显著性差异,即ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01对褐飞虱无致死作用。
(4)连续喂食ds1-21E01、ds2-21E01和ds3-21E01,直至褐飞虱若虫羽化,将雌雄成虫配对置于稻苗上产卵,待下一代卵孵化成若虫后,检测其体内21E01的表达量。结果表明:与取食ds-GFP成虫产生的后代相比,取食ds1-21E01的褐飞虱后代体内21E01基因表达量显著高于对照;取食ds2-21E01和ds3-21E01的褐飞虱后代体内21E01基因的表达量与对照之间无显著差异。这说明在本试验条件下,褐飞虱的RNA干涉是非系统性的,不能遗传给后代。本研究建立了一个基于dsRNA喂食的高效、操作便利的褐飞虱RNA干涉技术体系,这是首篇关于褐飞虱RNA干涉技术体系的研究。本技术将为褐飞虱功能基因组学提供有力工具,并为通过RNA干涉技术防治褐飞虱提供新的思路。