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目的在课题组前期相关研究的基础上,应用槲皮素干预大鼠后,以参与胆固醇摄入、转运、合成和转化途径中重要的受体蛋白、限速酶和转录调控因子为切入点,从酶蛋白活性、基因水平表达和蛋白水平表达三个层次,分析探讨槲皮素影响胆固醇代谢的具体途径和相关生物学机制,以期揭示槲皮素作用的具体靶点,为充分认识植物化学物的健康效应和合理应用提供理论和实验依据。方法1.槲皮素对血脂水平和主动脉弓胆固醇含量的影响24只健康雄性Wistar大鼠在体重均衡的基础上随机分为正常对照组和槲皮素干预组,每组12只。正常对照组大鼠喂食AIN-93G配方饲料,槲皮素干预组大鼠在前期筛选出槲皮素适宜干预剂量的基础上,在AIN-93G配方饲料中添加0.4%的槲皮素,分笼饲养,自由进食饮水,共喂养5周。喂养期间每天记录饲料摄入量,每周称量动物体重,密切观察动物生长情况。应用眼眶后静脉从采血法收集第2周、第4周和第5周大鼠血液,测定血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triacylglycerol,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平;喂养期结束后,乙醚麻醉下处死动物,分离大鼠主动脉弓血管,测定血管组织中TC、游离胆固醇(free cholesterol,FCH)和胆固醇酯(cholesteryl esters,CE)的含量。2.槲皮素对低密度脂蛋白受体表达的影响按上述方法喂养动物5周后,处死大鼠取肝脏和主动脉弓组织,观察LDL-C摄入过程中低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor,LDLR)的表达变化。应用Real-time PCR的方法检测肝脏和主动脉弓组织中LDLR在基因水平表达的变化,应用Western blotting的方法检测肝脏和主动脉弓组织中LDLR在蛋白水平表达的变化。3.槲皮素对胆固醇转运蛋白表达的影响按上述方法喂养动物5周后,处死大鼠取肝脏和主动脉弓组织,观察胆固醇外排转运过程中重要的转运体蛋白表达和调控的变化。应用Real-time PCR的方法检测肝脏和主动脉弓组织中三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、三磷酸腺苷结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)和上游转录调控因子肝X受体α(liver X receptorα,LXRα)在m RNA水平的表达,应用Western blotting的方法检测肝脏和主动脉弓组织中ABCA1、ABCG1和LXRα在蛋白水平表达的变化。4.槲皮素对肝脏胆固醇合成途径的影响按上述方法喂养动物5周后,处死大鼠迅速摘取肝脏,观察胆固醇合成途径中限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(hydroxymethyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG CR)的活性、表达与调控的变化。应用超速离心法分离大鼠肝脏微粒体后,采用酶偶联法测定肝脏微粒体中HMG CR的活性。应用Real-time PCR方法检测HMG CR和上游转录调控因子固醇调控元件结合蛋白-2(sterol regulatory element-binding protein-2,SREBP-2)在转录水平的表达,应用Western blotting的方法检测HMG CR和SREBP-2在蛋白水平的表达变化。5.槲皮素对肝脏胆固醇转化途径的影响按上述方法喂养动物5周后,处死大鼠迅速摘取肝脏,观察胆固醇转化途径中限速酶胆固醇7α羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)的活性、表达与调控的变化。应用超速离心法分离大鼠肝脏微粒体后,应用高效液相色谱(HPLC)的方法,以CYP7A1催化内源性胆固醇生成7α-羟胆固醇,进而转变为7α-羟-4胆甾烯-3-酮(7α-hydroxy-4-cholesten-3-one,HCO)的多少表示肝脏微粒体中CYP7A1的活性。应用Real-time PCR方法检测CYP7A1和上游转录调控因子法尼酯受体(farnesoid X receptor,FXR)和LXRα在转录水平的表达,应用Western blotting的方法检测CYP7A1、FXR和LXRα在蛋白水平的表达变化。结果1.槲皮素对血脂水平和主动脉弓胆固醇含量的影响动物喂养期间,对照组和槲皮素干预组动物的饲料摄入量和动物体重,从第1周至第5周均未出现统计学差异(P>0.05),可以排除因处理因素不同造成的影响。通过测定第2周、第4周和第5周三个时间点动物血脂水平,发现在0.4%槲皮素干预5周时,大鼠血清中LDL-C的浓度显著高于正常对照组(P<0.05),而在第2 w和第4 w时血清中LDL-C的含量在两组比较中未出现统计学差异(P>0.05)。血清中的TC、TG和HDL-C含量两组比较均未出现差异(P>0.05)。槲皮素干预组与对照组相比,主动脉弓TC、FCH和CE的含量与对照组相比较均显著下降(P<0.05)。2.槲皮素对LDLR表达的影响0.4%的槲皮素干预动物5周后,大鼠肝脏和主动脉弓组织中LDLR在基因水平的表达均显著上调(P<0.05),同时LDLR在蛋白水平的表达也显著升高(P<0.05)。可以更多的摄入血液循环中的LDL-C。3.槲皮素对胆固醇转运蛋白表达的影响0.4%的槲皮素干预动物5周后,可以显著提升主动脉弓组织中ABCA1和ABCG1在m RNA转录水平的表达,同时上游转录调控因子LXRα在转录水平的表达也显著升高(P<0.05)。在肝脏中,ABCA1在m RNA转录水平和蛋白水平的表达两组比较未出现统计学差异(P>0.05),但是在槲皮素干预组中,肝脏ABCG1在m RNA转录水平和蛋白水平的表达显著高于正常对照组(P<0.05),同时,上游转录调控因子LXRα在转录水平和蛋白水平的表达也显著升高(P<0.05)。4.槲皮素对肝脏胆固醇合成的影响0.4%的槲皮素干预动物5周后,通过连续监测340nm波长处NADPH吸光度值的变化,可以精确测定大鼠肝脏微粒体中HMG CR的活性。结果显示,尽管大鼠肝脏中HMG CR的活性有下降的趋势,但是与正常对照组比较未出现统计学显著差异(P>0.05),HMG CR在m RNA转录水平的表达与对照组比较却明显下调(P<0.05),酶蛋白在蛋白水平的表达两组比较未出现统计学显著变化(P>0.05)。上游转录调控因子SREBP-2在m RNA转录水平和蛋白水平的表达均未出现统计学显著差异(P>0.05)。5.槲皮素对肝脏胆固醇转化的影响0.4%的槲皮素干预动物5周后,通过HPLC检测大鼠肝脏微粒体中HCO量的多少,可以直接反映出CYP7A1的活性。结果显示,0.4%的槲皮素干预组动物肝脏CYP7A1的活性与正常对照组相比较显著升高(P<0.05),肝脏CYP7A1在m RNA转录水平和蛋白水平的表达也明显上调(P<0.05)。上游转录调控因子FXR在m RNA转录水平和蛋白水平的表达两组比较未出现统计学差异(P>0.05),但是另一重要的转录调控因子LXRα在转录水平和蛋白水平的表达显著升高(P<0.05)。结论1.0.4%槲皮素干预Wistar大鼠5周后,可以明显降低主动脉弓血管等组织中TC、FCH和CE的含量,引发血清中LDL-C浓度的升高,说明槲皮素具有影响机体胆固醇的代谢和改变胆固醇在体内分布的作用。2.0.4%槲皮素干预Wistar大鼠5周后,可以显著上调肝脏和主动脉弓组织中LDLR在转录和蛋白水平的表达,有利于摄入循环中的LDL-C,因此具有调节LDLR途径的作用。3.0.4%槲皮素干预Wistar大鼠5周后,可以通过上调主动脉弓组织中LXRα在转录水平的表达促进ABCA1和ABCG1的m RNA表达,同时在肝脏也是通过上调LXRα在转录和蛋白水平的表达,促进ABCG1在转录和蛋白水平的表达,说明槲皮素可以加速组织细胞中胆固醇的外排转运,有利于降低组织细胞中胆固醇的浓度。4.尽管槲皮素对胆固醇的代谢具有调节作用,但是根据槲皮素对HMG CR的活性、表达与调控的研究结果,可以确定槲皮素对胆固醇的合成途径影响甚微,槲皮素调节胆固醇代谢作用的靶点不在于合成途径。5.0.4%槲皮素干预Wistar大鼠5周后,可以提升CYP7A1的活性和表达水平,但是这种调节作用是通过上调LXRα在转录水平和蛋白水平的表达实现的,并非是由FXR引起的。槲皮素可以通过促进胆固醇向胆汁酸的转化,促进体内胆固醇外排。