【摘 要】
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本研究利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、荧光分光光度技术、圆二色性光谱技术(CD)、多级质谱技术(LC/MS/MS)、竞争法酶联免疫技术(ELSIA)以及生物传感技术(Biosense)
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本研究利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、荧光分光光度技术、圆二色性光谱技术(CD)、多级质谱技术(LC/MS/MS)、竞争法酶联免疫技术(ELSIA)以及生物传感技术(Biosense)等对丝组二肽(SH)的蛋白质切割功能从活性定量、底物选择性、切割机制等方面进行了较为深入的研究,并对组丝二肽(HS)与蛋白质的相互作用进行了相应的对比研究.同时对利用丝组二肽的蛋白质切割功能设计模拟抗体酶以及利用竞争ELSIA法筛选肽活性物质的方法进行了探索.主要研究结果如下:1,1mM丝组二肽对绿色荧光蛋白GFPxm18在PH为6.8的BR缓冲体系下,当反应温度为50℃时的切割速度为4.63×10<-4>mM/hr,其切割活性相当于天然蛋白质酶K的0.33×10<-4>mmol;体系中的PO<-4>有助于SH对蛋白质的切割,而柠檬酸却对SH的切割具有抑制作用.2,通过用SDS-PAGE结合荧光光谱技术研究发现丝组二肽对蛋白质的切割活性具有一定程度的底物选择性,主要表现为对α-螺旋含量较高的蛋白质切割活性较低,而对β折叠以及自由LOOP区含量较高的蛋白质具有较高的切割活性.3,在用荧光光谱技术对丝组二肽的切割活性进行实时跟踪时发现,丝组二肽在近中性的室温条件下,可以对GFP的荧光产生一定程度的淬灭作用,而组丝二肽却表现出对GFP荧光的增强作用,同时其淬灭或增强的程度同样表现出一定程度的底物选择性.4,丝组二肽与组丝二肽弱相互作用的圆二色性分析.5,探讨了利用竞争法酶联免疫技术(ELSIA),对合成肽库中的肽活性物质进行初步筛选的可行性.6,探讨了基于丝组二肽切割功能的模拟抗体酶设计的可行性,设计了3种SH与乙肝抗原可变区融合表达的融合蛋白,利用生物传感技术对其切割功能进行了测试.
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