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实验目的Cryptochrome 1(Cry1)基因是哺乳动物生物钟基因成员。主要在昼夜节律、免疫应答、糖类代谢等过程中发挥重要作用。研究表明CRY1在精原细胞瘤中表达异常减少,但其在雄性生殖功能中的作用仍未阐明。本研究拟通过Cry1敲除小鼠模型,研究其在雄性小鼠生殖功能中的重要作用。实验方法1.测序、免疫荧光、Western blotting的方法验证Cry1敲除小鼠。2.通过HE观察纯合雄性Cry1敲除小鼠与野生型(wild type,WT)小鼠的睾丸组织形态学改变,TUNEL实验观察睾丸凋亡情况,并用牛鲍计数板进行精子计数。利用ELISA方法检测纯合雄性Cry1敲除小鼠与WT小鼠的睾酮水平。3.通过DGE方法对Cry1敲除小鼠与WT小鼠睾丸表达谱进行分析。4.通过PANTHER软件进行Gene Ontology(GO)分析,STRING v.10.0了解和预测蛋白间的相互作用,并利用Tanget Scan和DIANA-TarBase v.7.0预测miRNA的靶基因,使用Cytoscape v.3.5.1软件构建mi RNA-mRNA调控网络。实验结果1.利用CRISPR-Cas9技术构建Cry1敲除小鼠,通过DNA测序、Western blotting的方法验证纯合雄性Cry1敲除小鼠构建成功。免疫荧光亚细胞定位显示:CRY1在WT小鼠睾丸的支持细胞、生精细胞和细胞间质中均有表达,而Cry1 KO小鼠睾丸组织CRY1未见明显表达。2.HE和TUNEL实验表明:纯合雄性Cry1敲除小鼠睾丸组织中发生退化和凋亡的生精细胞数量增加。与WT小鼠相比Cry1敲除小鼠精子数量减少(P<0.05),表明Cry1基因缺失影响睾丸精子发生。ELISA结果显示Cry1敲除小鼠睾酮水平与WT小鼠相比并未发生明显改变。3.高通量测序结果表明:纯合雄性Cry1敲除小鼠与WT小鼠相比375个基因发生明显变化。生物信息学分析显示:差异基因主要与细胞间信号传导、代谢、染色体重组、精子生成、免疫反应等生物学程序密切相关。实验结论Cry1缺失导致雄性小鼠睾丸生物学功能损伤,其可能通过影响睾丸免疫反应、精子生成等过程参与生精功能。