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RNA沉默是生物体中普遍存在的一种由同源序列引起的RNA降解过程,病毒或转座子入侵、以及体内产生的各种异常结构RNA都可能成为诱导RNA沉默发生的因素.为了认识同源性RNA的结构形式和表达剂量对诱发植物基因沉默的影响,以及某些植物病毒编码蛋白对基因沉默的抑制作用,为深入了解植物基因沉默的机制提供更多的资料,该论文就以下内容开展了研究.分别以低拷贝(pBIN19)和单拷贝(pMW75515J)的双元载体为骨架,构建了NOS终止子缺失的GFP基因(GFP-ΔTnos)表达载体.采用农杆菌浸润法(agro-infiltration)感染转基因本生烟16C,并对同源基因瞬时表达所引起的植物表型变化、小分子RNA的产生、DNA甲基化程度、以及相关性状在后代中的遗传情况进行了检查.根据发生沉默的时间早晚、发生沉默的植株比例以及程度的观察,发现GFP-ΔTnos载体诱发同源基因沉默的效率明显高于含有完整表达单元的同类载体;低拷贝载体诱发同源基因沉默的效率明显高于含有相同表达单元的单拷贝载体.在发生沉默的植株体内,在GFP蛋白及RNA被不同程度降解的同时,可以检测到21-26nt的小分子RNA(siRNA),同时GFP基因编码区也受到显著地甲基化修饰.这种转录后基因沉默(PTGS)现象可以在植株体内系统传播,但不能遗传给后代.接种野生型本生烟后的RT-PCR结果表明,GFP-ΔTnos载体瞬时表达所产生的GFP RNA可能没有poly(A)尾序.以上结果表明,同源性基因表达产物的结构形式及其在植物体内的表达剂量是影响PTGS能否发生以及发生程度的两种互相关联的关键因素.获得了含有GFP-ΔTnos表达载体的转基因本生烟,在部分转基因株系中GFP基因的表达受到抑制.Northern分析显示:GFP-ΔTnos载体所表达的GFP基因产物多数滞留在细胞核内部,不能被运送到细胞质中.筛选含有单个GFP基因(GFP1)或3个串联重复GFP基因(GFP3)的转基因烟草,获得荧光表型基本一致的纯合株系.用含有GFP基因的PVX病毒载体(PVX-GFP)接种后,GFP3株系对PVX-GFP侵染的抵抗能力明显高于GFP1株系.分子检测结果显示,GFP3植株中普遍存在GFP基因的沉默现象,且GFP DNA的甲基化程度明显高于GFP1植株,说明这些植株对于病毒的抗性与目的基因的插入位点及拷贝数和无关,但与串联重复的GFP基因结构形式密切相关.将RBSDV S6基因组分和BNYVV RNA2的14kD蛋白基因分别插入经改造的PVX病毒载体,与正常的GFP表达载体共侵染本生烟.表型观察和分子检测表明,S6和14kD基因可以对GFP基因的沉默产生不同程度地抑制作用,且S6对同源基因DNA的甲基化具有抑制功能.S6和14kD都能够逆转由GFP-ΔTnos载体引起的GFP基因沉默,其中S6基因的能力较强.同时,研究了RBSDV其他一些基因组成分对基因沉默的影响,发现编码两个蛋白的S7组分,以及S8组分对GFP基因沉默抑制效果较为明显.