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目的:本实验通过制作面神经上颊支压榨损伤动物模型,以穴位电针作为干预手段,采用免疫组织化学SP法和实时荧光定量多聚核苷酸链式反应法(Real-time qPCR)研究家兔面神经核中N-cad和P-cad的半定量与定量的表达情况,探讨穴位电针对面神经受损后面神经核中N-cad和P-cad表达的影响。 方法:共选用成年健康的新西兰家兔104只。其中免疫组织化学法检测组,设立正常对照组、手术对照组、针刺治疗组三个实验组;正常对照组选新西兰家兔4只,手术对照组(24只)、针刺治疗组(24只)分别按术后1天、4天、7天、14天、21天、28天六个时间点,每个时间点选4只,共52只。实时定量PCR法检测组,也按上述分组方法,选用52只新西兰家兔。正常对照组不作任何处理,直接取含面神经核的脑桥中下部组织进行免疫组化和实时定量PCR检测。手术对照组、针刺治疗组制作右侧面神经上颊支压榨损伤动物模型,损伤程度符合SunderlandⅣ度。术后两小时,针刺治疗组电针刺激翳风、颧缪、颊车、地仓、阳白、四白及合谷穴,每天1次,每次30分钟;而手术对照组术后不做处理。在术后按六个不同时间点经麻醉、经心灌注、预固定等方法取家兔脑桥中下部脑组织,通过固定、漂洗、脱水、包埋制成石蜡切片,然后运用免疫组织化学SP法检测面神经核运动神经元中N-cad和P-cad的蛋白表达的变化,光镜下计数两种钙粘附分子标记阳性的细胞数,应用SPSS17.0软件进行统计学分析。Real-time qPCR法检测组的实验动物模型制作与免疫组化组相同,模型制作完成后,术后按六个不同时间点,耳缘静脉空气栓塞,在冰台上取脑桥上缘以下到脑桥下缘3mm以上的脑组织,液氮冻存,-80℃冰箱内保存。经总RNA提取、PCR引物的制备、逆转录反应、对cDNA进行扩增等步骤,检测面神经核运动神经元中粘附分子N-cad和P-cad mRNA的定量表达情况,应用SPSS17.0软件进行统计学分析电脑输出目的基因的RQ值。 结果:免疫组织化学SP法检测组:正常对照组粘附分子N-cad、P-cad均无阳性表达。术后1天手术对照组出现了两种粘附分子标记的阳性细胞(N-cad18.66±4.04、P-cad37.30±3.51),阳性细胞DAB染色后呈棕黄色,表达在面神经核运动神经元角细胞胞浆中;针刺治疗组同一时间段,两种分子标记的阳性细胞数明显增多(N-cad48.67±2.08、P-cad61.00±6.00)针刺治疗组两种分子的阳性细胞数比手术对照组高,差异有显著统计学意义(p<0.01);术后4天手术对照组两种分子均有阳性表达(N-cad21.33±4.51、P-cad42.67±2.52),针刺治疗组(N-cad72.31±8.33、P-cad87.00±4.58)两种分子的阳性细胞数及表达强度均达到高峰,针刺治疗组与手术对照组比较,差异具有显著统计学意义(p<0.01);术后7天手术对照组(N-cad22.00±4.36、P-cad48.00±1.00),针刺治疗组两种分子的表达仍维持在高表达水平(N-cad68.33±2.08、P-cad84.33±569),针刺治疗组与手术对照组比较差异具有显著统计学意义(p<0.01);术后第14天,手术对照组P-cad(54.33±1.53)的阳性表达达到最高峰,针刺组两种分子的阳性表达有下降趋势N-cad(53.67±2.52)、P-cad(76.67±6.03),针灸治疗组与手术对照组比较差异具有显著统计学意义(p<0.01);术后第21天,手术对照组N-cad无阳性表达、P-cad(44.00±4.58),针刺治疗组两种分子均有阳性表达N-cad(31.33±3.51)、P-cad(69.00±7.94),针刺治疗组与手术对照组比较差异具有显著统计学意义(p<0.01);术后第28天,手术对照组N-cad无阳性表达,P-cad仍有阳性表达(38.00±8.89),针刺治疗组N-cad无阳性表达、P-cad有阳性表达(56.33±3.21)。针灸治疗组与手术对照组比较,N-cad的阳性表达,差异无统计学意义(p>0.05),而P-cad的阳性表达则反之。自术后21天开始手术对照组无N-cad阳性表达,而在术后第21天仍见针刺组N-cad有阳性表达。采用Real-time qPCR法获得两种分子在不同时间点目的基因的相对表达量RQ值。正常对照组N-cad基因的RQ值为(1);手术对照组N-cad基因的RQ值在术后1天、4天、7天、14天、21天、28天分别为(0.881±0.110)、(1.145±0.202)、(1.164±0.199)、(1.257±0.177)、(1.089±0.189)、(1.065±0.094);针灸组N-cad基因的RQ值在上述时间点分别为(1.1±0.179)、(1.467±0.218)、(1.495±0.211)、(1.703±0.231)、(1.349±0.169)、(1.267±0.164)。进行组间两两比较,针刺治疗组各时间点的表达量均比手术治疗组高,统计学分析具有统计学意义(P<0.05)。正常对照组P-cad基因的RQ值为(1);手术对照组P-cad基因的RQ值在上述时间点分别为(0.629±0.119)、(1.039±0.249)、(1.223±0.224)、(1.258±0.206)、(1.103±0.286)、(1.097±0.181);针刺组P-cad基因的RQ值在上述各个时间点分别为(0.775±0.116)、(1.306±0.189)、(1.459±0.233)、(1.748±0.282)、(1.369±0.187)、(1.244±0.167)。进行组间两两比较,在术后第1天针刺治疗组与手术对照组比较,无统计学意义(P=0.062)。针刺治疗组在其余时间点的表达量均比手术对照组高,具有统计学意义(P<0.05)。 结论:1.面神经损伤的早期即出现两种分子的阳性表达,其中P-cad的表达自术后一直存在,而N-cad表达时间相对较短,穴位电刺激能够促进这两个分子的高表达,表现在P-cad表达高峰前移与N-cad持续时间延长上。2.既往研究表明P-cad不具备促进神经再生的生物学功能,而穴位电针刺激其高表达,说明面神经促进再生是一个复杂的多因素参与的过程。3.穴位电针促进面神经再生可能与维持粘附分子的高表达有关。这种高表达可能是通过促进跨突触的信号传递来促进面神经再生,从而推断穴位电刺激促进面神经再生的机制可能是通过影响信息分子间的信号传导来实现。