家蝇酚氧化酶原免疫制剂的制备

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酚氧化酶,作为一种广泛存在于各种生物体的重要蛋白,在昆虫体液免疫和细胞免疫中均起到了极其重要的免疫作用,在生物体其一般以酚氧化酶酶原的形式存在。虽然对昆虫酚氧化酶及酶原的研究已经一个多世纪了,但在家蝇方面却没有其功能的相关报道,为探究家蝇体内酚氧化酶的功能,并制备家蝇酚氧化酶原免疫制剂,本文利用家蝇这一常见的生物,将家蝇酚氧化酶原基因与已发表并探明功能的部分昆虫酚氧化酶原基因进行比对与分析,预测家蝇酚氧化酶具有酚氧化酶的一般功能,本文将家蝇酚氧化酶原基因1的ORF克隆出来、装入pET-30a中进行了原核表达,建立了原核表达的家蝇酚氧化酶原包涵体变性复性为可溶性蛋白的有效方法,并对获得的可溶性蛋白的酶活性进行了检测。另外,利用原核表达的家蝇酚氧化酶原制备了多克隆抗体,并通过抗体封闭、RNAi实验,研究了家蝇三龄幼虫中的酚氧化酶原的免疫功能,结果显示,家蝇体内的酚氧化酶原蛋白及基因分别在抗体封闭和dsRNA干扰后,家蝇酚氧化酶的活性显著降低,家蝇死亡率显著升高,说明家蝇酚氧化酶原在家蝇的免疫反应中有重要作用。实验中,初步制备了家蝇酚氧化酶原的免疫制剂,并初步探究了其功能,为之后进行免疫制剂的更深入研究提供了理论基础。
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