苹果芽变的频率高,芽变在其育种工作中发挥巨大的作用,目前生产上广泛种植的许多优良品种和品系都是通过芽变育种获得的。短枝变异为芽变类型的一种。前期研究结果表明逆转座子atrl参与了苹果的短枝变异,并利用反向PCR获得了atrl的3’-LTR和RT等部分酶区序列；基于atr1-LTR的IRAP和染色体步移法在“元帅”四个短枝变异品种“玫瑰红”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和“华帅一号”均获得了一约1722 bp的特异性扩增条带。本研究在此基础上,利用逆转座子atrl序列特征和染色体步移法获得了atrl全长,序列分析结果表明atrl为一典型的Ty1-copia类逆转座子。利用染色体步移法扩增四个短枝变异品种“玫瑰红”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和“华帅一号”中特异片段的侧翼序列,在四个短枝变异品种中均获得一长度为4345 bp的特异片段,序列比对分析发现四个短枝变异品种中的特异性片段相同,提交苹果基因组网站分析,结果暗示此特异序列可能是逆转座子携带其旁侧序列转座插入到新位点所致。1.逆转座子atrl全长的分离1.1利用逆转座子序列特征分离逆转座子atrl在前期获得atr1-3’-LTR、RT以及部分3’端旁侧序列2124bp基础上,根据Tyl-copia缸类逆转座子的序列结构特征,依据3’-LTR设计正向引物,根据5’-RT序列设计反向引物,进行巢氏PCR,获得atrl大部分序列,仅缺少5’-LTR的5’端少数碱基。1.2利用反向PCR分离atrl的5’-LTR及其5’端侧翼序列利用限制性内切酶VspⅠ酶切玫瑰红基因组DNA,T4连接酶将酶切片段自连环化作为PCR模板,进行巢氏PCR,得到逆转座子atrl的5’-LTR及其侧翼序列。1.3逆转座子atrl全长的验证及其在苹果基因组的分布利用拼接所得逆转座子atr1-5端旁侧序列设计正向引物,3’端LTR序列加接头设计反向引物,进行巢氏PCR,得到序列长度为4996 bp的逆转座子atrl全长。经分析,atrl为典型的Tyl-copia类逆转座子,包含了"5’-LTR,GAG区,INT区,RT区,RNaseH区和3’-LTR”。将atrl提交苹果基因组网站进行比对,发现其在苹果基因组内同源序列较多,表明该逆转座子具有转座活性且参与了苹果基因组的进化。选择与atrl相似度最高的10条序列进行比对,分析发现一酶区与atrl功能区相似性高达96.4%的序列“MDC018640.562”的侧翼各有5 bp的插入位点(AGACA),但其LTR与atrl相似度仅为65.24%。而与atrl酶区及LTR相似度都很高的逆转座子侧翼都没有插入位点序列。2.“元帅”系四个短枝变异品种“玫瑰红”、“矮红”、“奥勒冈矮生”和“华帅一号”中特异性位点的分离2.1利用TAIL-PCR分离四个短枝变异品种中特异片段1722 bp的5’-端旁邻序列利用已获得的4个短枝变异品种中特异性扩增片段1722 bp设计引物,借助TAIL-PCR方法分离1722 bp的5’-端旁邻序列,所得序列与1722 bp拼接并验证后获得一1964 bp的片段。分析结果显示四个短枝变异品种中1964 bp相同,PCR检测结果表明1964bp为“元帅”系四个短枝变异品种中特异性扩增条带。2.2借助苹果基因组序列分离四个短枝变异品种中特异片段1722 bp的3’-端侧翼序列将1722bp提交苹果基因组比对,发现3’-端1148 bp在苹果基因组中存在多条相似度高达90%以上的序列。将这些序列分析后选出一段共同系列,与1722 bp的3’端拼接,在1722 bp的5’端270 bp处设计上游引物进行验证,分离一长度为2271 bp的序列,新分离的3’-端序列长度为859 bp。分析结果显示四个短枝变异品种中2271 bp相同,PCR检测结果表明2271 bp为“元帅”系四个短枝变异品种中特异性扩增条带。2.3利用hiTAIL-PCR分离四个短枝变异品种中特异片段1964 bp的3’-端侧翼序列利用已获得的四个短枝变异品种中特异性扩增片段1964 bp设计引物,借助HiTAIL-PCR方法分离1964 bp的3’-端旁邻序列,所得序列与1964 bp拼接并验证后获得一3032 bp的片段,新分离的3’-端序列长度为1010 bp。分析结果显示四个短枝变异品种中3032 bp相同,PCR检测结果表明3032bp为“元帅”系四个短枝变异品种中特异性扩增条带。2.4利用反向PCR分离四个短枝变异品种中特异片段3032 bp的5’-端侧翼序列选用限制性内切酶Sph Ⅰ酶切玫瑰红基因组DNA,利用反向PCR分离3032 bp的5’端侧翼序列,与3032 bp拼接后,获得一长度为4345 bp的片段。分析结果显示四个短枝变异品种中4345 bp相同,PCR检测结果表明4345 bp为“元帅”系四个短枝变异品种中特异性扩增条带。