卵菌是一类与真菌在系统发育上相距甚远的病原菌,通常造成严重的作物产量损失和环境破坏。卵菌中的疫霉属病菌侵染植物形成的病害通常是毁灭性的,研究植物与它们之间的互作机理能够为更好地防控此类病害提供理论依据。病菌侵染植物过程中会招募植物感病因子来帮助它们侵入、抑制植物免疫和扩展。对某种病菌的寄主来说,感病是常态,研究感病因子的感病机理,有助于人们了解病害的发生过程,也有助于从中开发新颖的抗病材料。寄生疫霉菌是疫霉属中的代表性病原菌,植物-寄生疫霉菌病害系统的建立有利于人们更好地对植物与疫霉菌在分子层面的互作机制进行研究。本实验室前期鉴定到一个对寄生疫霉菌表现出抗性的拟南芥T-DNA插入突变体,实验确认其中被T-DNA插入的基因编码一个Raf-like类型的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶:Raf36。植物Raf-like激酶调控胁迫反应及其它多种生命活动。本研究中,我们通过分子生物学和遗传学方法对Raf36负调控植物免疫的功能和机制进行了探究。另外,我们也分析了拟南芥Raf36参与抗病信号通路的情况及其在烟草中的功能保守性。主要的研究内容与结果如下:第一,Raf36是拟南芥对寄生疫霉菌和辣椒疫霉菌抗性的负调控因子。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在拟南芥野生型Col-0植株中敲除Raf36基因,得到的突变体对寄生疫霉菌的抗性增强;当在敲除突变体中回补或过量表达Raf36后,植株对寄生疫霉菌的敏感性得到恢复和增强。另外,通过对Raf36的敲除突变体和过表达转化子接种辣椒疫霉菌和灰霉菌,我们发现Raf36也负调控拟南芥对辣椒疫霉菌的抗性,但不响应灰霉菌的侵染。第二,Raf36基因负调控植物抗性的功能在烟草中保守。利用病毒诱导的基因沉默技术沉默拟南芥Raf36在烟草中的同源基因Nb Raf36s并接种寄生疫霉菌后发现,Nb Raf36s沉默植株表现出比野生型植株更强的抗病性。第三,Raf36不响应乙烯信号。对Raf36的敲除突变体和过表达转化子施加乙烯前体ACC后,产生的乙烯三重反应与野生型植株类似。检测受病菌侵染不同时间点植株中的乙烯合成和信号传递相关基因表达情况,发现它们在raf36植株和野生型植株中的表达模式无明显差异。第四,Raf36与MAPKK激酶MKK2在植物体内互作,且该互作依赖Raf36的激酶活性。免疫共沉淀分析和荧光素酶互补分析表明,Raf36与MKK2能够在植物体内互作;共表达分析和双分子荧光互补分析表明,Raf36能够与MKK2在细胞质内共定位。酵母双杂交方法分析表明,Raf36与MKK2之间互作的关键区域为Raf36含激酶结构域的C端及部分的N端序列,激酶失活的Raf36不能与MKK2互作。第五,MKK2正调控植物对寄生疫霉菌的抗性。通过对MKK2的基因敲除突变体、基因回补转化子和过表达转化子进行寄生疫霉菌接种测试,发现在拟南芥中敲除MKK2使植株对寄生疫霉菌更感病;将MKK2回补到敲除突变体中能恢复植株对寄生疫霉菌的抗性;而过表达MKK2则使植株的抗病性明显增强。第六,MKK2对raf36介导的抗病性有贡献。构建拟南芥mkk2 raf36双基因敲除突变体并对其进行寄生疫霉菌接种测试后发现,mkk2 raf36双基因敲除突变体表现出比raf36单基因敲除突变体明显更强的感病性,说明Raf36和MKK2的双基因突变抑制了由单个Raf36基因突变产生的抗病性,进而说明拟南芥Raf36位于MKK2所处信号通路的上游。在烟草上分别瞬时过表达拟南芥Raf36和MKK2的激酶失活突变体后接种寄生疫霉菌,我们发现它们的激酶活性对两个激酶行使感病或抗病功能非常重要。在烟草叶片中瞬时过表达At MKK2的底物At MPK6及其激酶失活突变体后接种寄生疫霉菌,我们发现At MPK6也调控植物对寄生疫霉菌的抗性,且该抗性也同样依赖At MPK6的激酶活性。综上所述,我们的研究验证了前期筛选到的拟南芥Raf-like激酶Raf36在植物对疫霉菌的抗性中发挥负调控功能,并证明它与MKK2在植物体内互作。与Raf36互作的MKK2在植物对寄生疫霉菌抗性过程中发挥正调控作用并位于Raf36下游。这些结果为Raf36作为突变后产生抗性的感病因子提供了充足的证据,为深入研究植物Raf-like激酶参与植物抗病性调控的分子机制打下了基础。