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利用干细胞的特性进行组织工程修复缺损器官是再生医学研究的热点，牙髓干细胞（human dental pulp stem cell，hDPSCs）取材简单，创伤小，是非常有应用价值的组织工程种子细胞。但研究发现其数量较少，体外培养扩增能力有限，增殖率低于胚胎干细胞，难以达到组织工程所需的细胞数量，有报道体外培养的hDPSCs“干性”特征随传代次数增加而减弱[1]。因此搞清牙髓干细胞自我更新的调控机制，找到调控其“干性维持”的靶点，将有助于解决牙髓干细胞应用的瓶颈问题。 我们的前期研究发现OCT4转录因子一个重要的选择性剪接体——OCT4A的表达下调与hDPSCs体外扩增后干性特征降低密切相关，此外与胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）相比hDPSCs内OCT4A表达量较低，以上结果提示OCT4A剪接体可能参与调控hDPSCs自我更新能力。 研究证实OCT4转录因子作为干细胞的多能性的标记物，参与维持ESCs和成体干细胞（Adult stem cells，ASCs）的干性特征。其pre-mRNA可被选择性剪接产生OCT4A、OCT4B、OCT4B1三个主要亚型，其中OCT4A亚型决定干细胞的多能性。而TIP110（squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells3）作为一种剪切因子，参与调节OCT4A mRNA的剪接。 本研究拟利用shRNA和高表达慢病毒载体研究OCT4A在hDPSCs干性维持中的调控作用，同时检测hDPSCs内TIP110对OCT4A表达调控，并探究TIP110对hDPSCs增殖、自我更新能力的影响；最后通过裸鼠体内移植实验进一步验证OCT4A和TIP110对hDPSCs的调控作用，为进一步研究通过TIP110调节OCT4A剪接体表达以调控hDPSCs多潜能性和自我更新能力奠定基础，并为研究hDPSCs干性维持机制以及组织工程临床应用提供新的思路和理论依据。 方法和结果： 1.hDPSCs分离、培养和鉴定 采用组织块联合酶消化法成功分离培养hDPSCs，通过检测细胞表面抗原及多向分化能力，结果表明我们已成功分离、培养获得hDPSCs。 2.OCT4A对hDPSCs自我更新能力的调控作用 体外二维条件下培养hDPSCs，并在P3代细胞利用shRNA和高表达慢病毒表达载体沉默和过表达OCT4A，分别检测各组间在增殖、分化能力以及克隆形成能力和干性分子表达的差异。 结果显示： （1）通过CCK-8实验检测各组增殖能力，发现沉默OCT4A后hDPSCs的增殖能力被明显抑制；过表达OCT4A后hDPSCs的增殖能力显著增加。 （2）细胞克隆形成实验（colony forming unit，CFU）检测结果显示沉默OCT4A后hDPSCs的克隆形成能力降低；而过表达OCT4A后hDPSCs的克隆形成能力增强。 （3）Real-Time PCR检测各组hDPSCs中干性分子Klf4、Sox2、Nanog、C-Myc的表达，发现在hDPSCs中沉默OCT4A后干性分子表达水平降低；过表达OCT4A则干性分子表达增强。 （4）成脂分化能力检测结果显示，油红O染色后镜下观察可见沉默OCT4A后实验组中形成的脂滴明显少于对照组；Real-Time PCR检测发现沉默OCT4A后实验组中PPARγ的表达受到了明显抑制；而过表达OCT4A可增加hDPSCs脂滴形成同时伴有成脂基因PPARγ的表达上调。 （5）矿化能力检测结果显示，茜素红染色后肉眼观可见沉默OCT4A后实验组染色强度明显弱于对照组，过表达OCT4A后实验组染色强度明显强于对照组；Real-Time PCR和显微镜观察可见沉默OCT4A可抑制钙化结节的形成及成骨/成牙相关基因DSPP、BSP、OCN、ALP的表达；而过表达OCT4A则可促进hDPSCs钙结节的形成和ALP、DSPP、OCN和BSP的表达。 体内移植实验显示将hDPSCs矿化诱导2周后接种于羟基磷灰石（HA-TCP）支架材料上，植入裸鼠体内8周，Masson及免疫组化染色结果显示沉默OCT4A后可抑制hDPSCs成骨/成牙向分化，过表达OCT4A则可促进成骨/成牙向分化，体内与体外结果一致。 3.TIP110对hDPSCs自我更新能力的调控作用 在hDPSCs中沉默TIP110后检测各组间增殖、分化、克隆形成能力和干性分子之间的差异。 结果显示： （1）Real-Time PCR检测沉默TIP110后hDPSCs中干性分子表达水平，发现沉默TIP110后 Klf4、Sox2、Nanog、C-Myc表达受到抑制。 （2）CCK-8实验结果显示沉默TIP110后hDPSCs的增殖能力显著降低。 （3）CFU实验结果显示沉默TIP110后实验组中hDPSCs形成的克隆数目明显少于对照组，表明沉默TIP110可抑制hDPSCs克隆形成能力。 （4）体外二维条件下诱导各组hDPSCs向成骨/成牙和成脂分化，通过茜素红和油红O染色及Real-Time PCR检测成骨/成牙及成脂相关基因，发现沉默TIP110后可明显抑制hDPSCs的分化能力。 （5）Real-Time PCR检测沉默TIP110后hDPSCs中OCT4剪接体（OCT4A,OCT4B和OCT4B1）表达水平，发现沉默TIP110后 OCT4A表达受到抑制，而OCT4B和OCT4B1表达无明显改变。 综上所述，本研究结果证实OCT4A在hDPSCs干性维持中发挥重要作用，TIP110在hDPSCs调控OCT4A的表达，同时也参与调控hDPSCs自我更新能力；本课题下一步的研究将进一步探讨TIP110通过调节OCT4A表达参与调控hDPSCs自我更新能力的机制，研究旨在解决hDPSCs在组织工程应用中的瓶颈问题，并为最终实现其在牙髓损伤和修复治疗中的应用提供相关理论基础。