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近年来,粮食中多种真菌毒素共存污染产生的协同毒性风险日趋增加,引发全球广泛关注。圆弧偶氮酸（Cyclopiazonic acid,CPA）作为一种新兴毒素广泛污染花生、无花果、玉米等食品,与污染范围最广和毒性最强的真菌毒素——黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）存在共暴露途径,且有报道显示二者可能产生协同毒性。因此,研究AFB1和CPA的协同毒性评价及干预控制非常重要。目前,毒素的体外毒性评价依然以贴壁细胞模型为主,但贴壁生长的细胞与体内微环境差异较大,存在很多不足。而多细胞共培养所构建的评价模型,相比单一细胞更能模拟体内实际生理环境,提高毒素毒性评价的精准性。因此本论文构建并优化了一种共培养肝细胞微球模型,对比贴壁模型与肝微球模型的差异,选出更加贴近体内微环境、仿生性更高的评价模型;将其用于AFB1和CPA的毒性评价,发现CPA与AFB1的协同毒性作用及干预机制,应用落新妇苷干预对毒素协同毒性有较好的缓解效果,为毒素毒性评价和控制奠定基础。主要研究内容如下:1.构建新型无支架肝微球模型并将其应用于AFB1的毒性评价。选用肝实质细胞Hep G2、内皮细胞EA.hy 926、星形细胞LX-2,通过细胞初始数量、细胞比例、培养时间等条件优化,构建三种不同的肝微球模型;以AFB1为研究对象,通过多项指标测试,对比肝微球评价模型的优势。结果显示,AFB1对贴壁细胞的细胞膜损伤显著（0.01μg/m L,24 h;p＜0.01）,还可显著影响贴壁细胞的活性、增殖活力和氧化应激水平（1.0μg/m L,24 h;p＜0.05）。相比之下,肝微球更不容易受到AFB1的影响。结合基因表达分析,发现肝微球的细胞色素P450酶和药物代谢酶活性都高于贴壁细胞,而且三种细胞共培养形成的肝微球更优于单种细胞形成的肝微球。因此,推断具有强肝功能和高代谢活性的共培养肝微球可以更好地自我调节以应对外来刺激引起的损伤,更加真实地模拟体内微环境,可作为后续毒性研究的评价模型。2.基于上述构建的共培养肝微球模型,研究AFB1和CPA的联合毒性效应及作用机制。根据AFB1和CPA单独暴露的毒性效果,选择了等毒性暴露和不同比例暴露两种模式刺激48 h,对AFB1及CPA的联合毒性进行研究。CI模型分析显示,AFB1+CPA的联合毒性受毒素剂量影响较大,而受浓度比例影响较小。在IC50比率下,AFB1和CPA在低剂量水平(＜1/8 IC50)会产生协同作用,高剂量水平(＞1/8 IC50)会转为拮抗作用。线粒体和活性氧（ROS）水平测试也得到了类似的联合效应趋势。基因表达分析显示,联合效应的转变可能与AKT基因及CPA的生物学活性有关。毒素刺激48 h,过表达AKT基因（13.28倍）的细胞活性即显著高于正常细胞（AFB1:3.06%,p＜0.001;AFB1+CPA:3.36%,p＜0.05）。3.利用代谢组学技术进一步分析AFB1和CPA作用于肝微球的代谢协同机制。基于前期实验,分别选择0.625μg/m L AFB1+3.125μg/m L CPA(1/16 IC50,协同)和5μg/m L AFB1+25μg/m L CPA(1/2 IC50,拮抗)两个剂量组合研究AFB1和CPA的代谢联合机制。结果显示,毒素组的代谢轮廓与对照组存在显著差异,且多种代谢物及代谢通路受到毒素影响。其中,低剂量的协同浓度点,乙醇胺、L-天冬氨酸等能量代谢物质代谢水平显著下调（p＜0.001）,而高剂量的毒素还显著影响了抗氧化物质的代谢水平（p＜0.01）。代谢通路富集也表明,各处理组的AFB1和CPA都对氨基酸代谢（丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸等）扰动较大,可能破坏胞内的氧化还原稳态。此外,含有CPA的毒素组扰乱了更多的代谢通路,还可能通过三羧酸（TCA）循环影响脂类和糖类代谢。4.探究落新妇苷干预对AFB1及其与CPA联合毒性的影响。在前期研究中发现,AFB1和CPA共暴露会影响胞内氧化还原水平,并产生协同毒性。因此,选用抗氧化活性提取物——落新妇苷,对AFB1和CPA的协同作用浓度点(1/16 IC50)进行干预。结果显示,落新妇苷有助于维持毒素暴露后的细胞活性,最高可将肝微球内的细胞抑制率降低9.36%（p＜0.001）,且提前干预的效果不如与毒素同时共暴露。此外,落新妇苷还可提高联合给药组的胞内线粒体含量,促进能量代谢。抗氧化能力表现更显著,10μg/m L的暴露浓度即可显著降低毒素引起的胞内ROS水平上升（p＜0.001）。代谢组学分析发现,落新妇苷干预影响了胞内的氨基酸代谢、糖代谢和脂代谢,使得其代谢轮廓与对照组更为接近。综上,本论文构建了一种共培养肝微球模型,并将其用于真菌毒素的毒性评价,提供了一种新型的仿生性更高的毒性评价模型。论文还探究了新兴真菌毒素CPA与AFB1共存时的联合毒性效应,为科学制定CPA的限量标准提供一定的理论基础。此外,AKT基因过表达和落新妇苷的干预研究还为抑制或缓解AFB1和CPA的毒性研究提供了思路。