近年来,CRISPR/Cas9技术因操作简单、耗时短等优势被广泛应用于多个领域。在家畜育种方面,已经利用CRISPR/Cas9技术成功构建了多种动物模型,这些育种模型的构建对于家畜新品种培育具有重要的参考价值。肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)作为骨骼肌增殖分化和生长发育的负调控因子,它的缺失或低表达均会导致肌肉肥大。二酰甘油酰基转移酶1(Acyl Co A:diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1)是调控甘油三酯合成的唯一的关键酶,在动物机体的脂肪代谢、脂类沉积等过程中起着重要作用。该研究主要利用CRISPR/Cas9技术构建DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠模型,为培育产肉量高且肉质鲜美的优良家畜新品种提供研究基础。研究结果如下:1.Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体的构建首先,根据CRISPR Design软件设计了4对gRNA并筛选出剪切活性较高的gRNA(命名为1-1),构建了T7-Cas9-gRNA表达载体和U6-Cas9-gRNA表达载体。此外,我们还以pc DNA3.0为骨架载体成功构建了针对MSTN位点的DGAT1定点整合载体。2.Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体在细胞水平的功能验证通过电穿孔转染法将构建成功的U6-Cas9-gRNA表达载体、DGAT1定点整合载体和pc DNA3.0空载体按不同的组合及比例转入C2C12细胞中。通过PCR检测发现在同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中随机整合鉴定和定点整合鉴定均出现了符合预期的条带。通过实时定量PCR检测发现,在转入U6-Cas9-gRNA表达载体组以及同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中,MSTN基因在mRNA水平的表达量均低于转入空载体组和未经转染组,而在同时转入U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体组中DGAT1基因的表达量则明显高于转入U6-Cas9-gRNA表达载体组、转入空载体组和未经转染组。结果表明,所构的U6-Cas9-gRNA表达载体和DGAT1定点整合载体不仅能实现DGAT1基因在MSTN基因位点的定点整合,还可以在mRNA水平实现MSTN基因低表达的同时DGAT1基因高表达。3.基因编辑小鼠模型的制备及鉴定通过原核注射技术将gRNA和Cas9 mRNA以及线性化的DGAT1定点整合载体注射到小鼠受精卵的原核中来制备基因编辑小鼠模型。本实验中,我们共获取4006枚小鼠受精卵,挑选其中状态良好的3041枚受精卵进行了原核注射,体外培养获得2082枚胚胎,将其移植到61只ICR代孕母鼠体内,共出生124只小鼠,最终存活111只,经PCR鉴定我们发现有4只DGAT1基因在MSTN位点定点整合小鼠,1只DGAT1基因随机整合且MSTN基因敲除小鼠,8只DGAT1基因随机整合小鼠,8只MSTN基因敲除小鼠,出生率为5.95%,阳性率为16.93%,定点整合效率为3.2%。