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疫苗是预防流感流行的主要有效手段,现阶段使用和在研的流感疫苗分为裂解灭活疫苗、亚单位疫苗和减毒活疫苗。流感减毒活疫苗(简称LAIV)以滴鼻方式接种,可引起包括体液免疫、粘膜免疫和细胞免疫在内的更为持久的免疫保护。目前只有美国和俄罗斯以鸡胚为基质生产减毒活疫苗。鸡胚生产疫苗存在卵清蛋白过敏和供应周期长等缺点,尤其是LAIV生产过程没有病毒灭活步骤,存在将鸡源性传染性病原体散播至人群的风险。Vero细胞是WHO推荐用于人用生物制品生产的细胞基质,可通过发酵罐大规模培养。然而,Vero细胞对流感病毒不敏感,多数流感病毒不能在Vero细胞上连续传代。国外虽然投入巨资开发Vero细胞流感疫苗,但全球仍未见以Vero细胞为培养基质生产的LAIV问世。选育流感病毒Vero细胞冷适应母本毒株对于LAIV的研发至关重要。国外仅见一株甲型冷适应株A/Singapore/1/57ca(H2N2)的报道,乙型的尚未见报道。本实验室经过10多年的研究,成功选育出甲型和乙型Vero细胞冷适应株A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2Vca)、B/Yunnan/1/2011Vca(BVca)。经鉴定,两株病毒能够在Vero细胞25℃稳定传代培养,且具有冷适应性(ca)、温度敏感特性(ts)和减毒特性(att)等表型特征。我们将 H3N2Vca 和 BVca 的 8 个基因片段(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS)克隆至双向表达载体PHW2000,筛选出能协同工作的8个质粒,拯救的毒株能在Vero细胞25 ℃稳定传代培养,且具备ca、ts和att特性,表明Vero细胞流感减毒母本株基因组库构建成功。按照6+2模式,将含H3N2Vca和BVca的6个内部基因的PHW2000质粒与含2013-2014年WHO推荐北半球季节性流感疫苗生产用毒株 A/ChristChurch/16/2010(H1N1)、A/Texas/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/2/2012(BY)的表面抗原基因 HA、NA 的 PHW2000 质粒,共转染293T细胞,拯救获得了三株Vero细胞LAIV候选株:A/ChristChurch/16/2010Vca、A/Texas/50/2012Vca、B/Massachusetts/2/2012Vca。经鉴定,重配毒株具有 ca、ts 和att特性,病毒形态轮廓清晰,为有囊膜病毒;蚀斑以及Western实验证明重配毒株能在Vero细胞上较好的增殖;测序结果显示,重配毒株在Vero细胞连续传代过程中表面抗原基因HA、NA未发生实质性改变。将Vero细胞在无血清培养基中传代建立了无血清Vero细胞库,液氮保存复苏成活:以0.1MOI的病毒量接种1:2传代无血清培养36 h的Vero细胞,在病毒维持液pH7.2-7.4、TPCK胰蛋白酶浓度0.8ug/ml时获得较高的病毒产量。将工作种子批病毒在Vero细胞大规模培养,病毒液经浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化,得到单价病毒液的ca、ts及att等表型特征没有改变。制成的三价LAIV滴鼻免疫小鼠,一免组免后28天抗H1N1、H3N2、BY抗体滴度分别为1:234.67、1:248.3和1:239.3;二免后抗体滴度继续升高,在28天时抗H1N1、H3N2、BY抗体滴度分别:1:490.667、1:606.7和1:485.3;一免和二免组免后14d肺洗液sIgA含量分别为2217.6ng/ml和3329.5ng/ml。免疫雪貂后,血清抗体滴度高达1:2000,其IL-4、IL-6等细胞因子的含量均显著高于阴性对照组。挑战试验证明Vero细胞三价LAIV能有效保护动物病毒感染。本研究首次在国际上构建了甲型和乙型Vero细胞流感减毒株的基因组库,并用于三价(四价)季节性LAIV病毒种子批的制备。后续制备的三价Vero细胞季节性LAIV具有较好的安全性和免疫保护效果。