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果胶是植物初生细胞壁的主要成分,同时也是花粉壁和花粉管壁的主要成分。果胶在维持细胞结构的完整性、细胞之间的连接以及防御反应的调控等方面发挥着重要作用。果胶的合成和降解需要一系列酶的参与。果胶甲酯酶(pectin methylesterases,PMEs)是第一类对果胶发生催化作用的酶,其活性受到果胶甲酯酶抑制子(pectin methylesterase inhibitors,PMEIs)的调控。PMEI家族成员众多。目前,已在多个物种中鉴定出PMEI基因,并证实其参与植物生长发育的多个过程,例如下胚轴伸长、花粉发育和花粉管生长、种子萌发、果实成熟以及各种胁迫响应等。在进化过程中,由于全基因组复制和串联复制等事件的发生,会产生许多重复PMEI基因。此外,全基因组复制事件后通常伴随着会引起大量基因丢失的二倍化事件,导致重复PMEI基因命运的改变。前人已对多个物种的PMEI基因家族成员的进化机制和表达特征进行了一定程度的分析。然而,PMEI基因家族成员在进化过程中的扩张模式,重复PMEI基因的表达特征,PMEI基因家族成员的保留和丢失机制,以及直系同源PMEI基因的比较和功能鉴定等方面尚不甚明了。在本论文中,我们以芸薹属物种白菜(Brassica campestris L.subsp.chinensis Makino,syn.B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝(B.oleracea)为实验材料,结合已公布的全基因组测序数据,对白菜和甘蓝PMEI基因家族成员的进化和表达模式进行了深入分析。此外,还对白菜和甘蓝PMEI基因家族的扩张模式、保留率和同源基因间的表达差异,以及PMEI基因家族成员在三个亚基因组上的分布情况进行了比较。为了进一步了解PMEI基因在花粉发育过程中的潜在功能,对白菜中的两个花粉特异表达基因BcPMEI1(基因ID:Bra013821)和BcPMEI85(基因ID:Bra017515),以及甘蓝中的一个花粉特异表达基因BoPMEI1(基因ID:Bol039450)进行了深入研究。获得的主要结果和结论如下:(l)在白菜全基因组中,鉴定出100个PMEI基因家族成员。染色体定位分析结果显示,96个PMEI基因无规则地排列在10白菜条染色体上,剩下的4个基因分别位于scaffold000164、scaffold000215、scaffold000257和scaffold000305上。检测出9组串联重复基因,它们共包含20个PMEI成员。对其与拟南芥的PMEI基因进行共线性分析,发现80对共线性直系同源基因。这些结果说明,全基因组三倍化和串联复制是白菜PMEI基因家族扩张的主要来源。在进化过程中,白菜PMEI基因的保留率为52%,符合“基因平衡理论”。其在LF亚基因组上的保留率(60%)显著高于其在MF1(50%)和MF2(42%)亚基因组上的保留率,这个现象与白菜全基因组在三个亚基因组上的基因保留情况一致,可以用“二步法理论”解释。对同源PMEI基因对的非同义替换率、同义替换率以及二者之间的比值进行分析,结果显示,白菜PMEI家族在进化过程中主要经历了纯化选择。通过qRT-PCR以及转录组数据分析,发现10个白菜PMEI基因成熟花粉粒中有高且特异的表达水平。分析白菜PMEI基因家族成员的启动子序列,发现许多与激素处理和胁迫响应相关的顺式作用元件。(2)与白菜一样,PMEI基因在甘蓝中也是一个很大的基因家族,共鉴定出95个甘蓝PMEI基因家族成员。染色体定位分析结果显示,79个甘蓝PMEI成员无规则排列在9条染色体上,其余16个成员不能被明确定位到染色体上,它们位于scaffold上。检测出10组串联重复基因,它们共包含21个PMEI成员。共线性分析结果显示,甘蓝和拟南芥的基因组间共存在77对直系同源PMEI基因。上述结果说明,甘蓝PMEI基因家族扩张的主要来源与白菜一样,都是全基因组三倍化和串联复制事件。在进化过程中,甘蓝PMEI基因的保留率稍低于白菜PMEI基因的保留率,但仍然高达50%;其在LF亚基因组上的保留率(60%)显著高于其在MF亚基因组上的保留率;但与白菜不同的是,甘蓝PMEI基因在MF1亚基因组上的的保留率(42%)低于其在MF2亚基因组上的保留率(47%)。非同义替换率和同义替换率分析结果显示,在进化过程中,与白菜PMEI成员所经历的的选择类型一致,甘蓝PMEI家族成员主要也是经历了纯化选择,且分歧时间与全基因组三倍化事件的发生时间相近。qRT-PCR分析结果显示,PMEI基因与甘蓝生长发育过程密切相关,其中5个基因在成熟雄蕊中有高且特异的表达水平。此外,在甘蓝PMEI基因家族成员的启动子区域,鉴定出许多与激素处理和胁迫响应相关的顺式作用元件。(3)基于BRAD的基因组信息,从白菜和甘蓝中分别克隆得到了BcPMEI1 和BoPMEI1的DNA序列和CDS全长。分析结果表明,BcPMEI1和BoPMEI1均含有2个外显子,1个内含子。二者所编码的氨基酸序列具有很高的相似性。信号肽预测和亚细胞定位实验结果表明,BcPMEI1和BoPMEI1是定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白。通过qRT-PCR分析,发现BcPMEI1和BoPEI1和均在成熟雄蕊中有很高的表达水平,但它们表达模式存在差异。(4)经BcPMEI1的过表达分析,发现转基因拟南芥植株约50%的花粉无活力、塌陷皱缩、体积变小,角果短、结籽数量少。半薄切片和超薄切片透射电镜观察结果表明,畸形花粉自单核时期出现异常,花粉内壁不能正常形成,内含物和细胞核最终完全降解。以上结果说明BcPMEI1可能通过调控花粉内壁形成过程中的果胶代谢过程,影响花粉发育。对启动子序列进行分析,结果显示,BcPMEI1和BoPEI1和的启动子序列相似性为84.35%,均含有花粉特异的基序和经典的顺式调控元件。启动子-GUS分析结果表明,BcPMEI1和BoPMEI1启动子驱动的GUS信号皆主要出现在成熟花药和花粉中。(5)基于BRAD的白菜基因组信息,通过克隆得到BcPMEI85的DNA序列和CDS全长。该基因没有内含子。亚细胞定位实验以及信号肽和跨膜结构域预测结果表明,BcPMEI85是一个定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白。BcPMEI85的启动子区域含有花粉特异的基序以及多个与激素处理和胁迫响应相关的顺式作用元件。通过启动子-GUS分析,发现BcPMEI85启动子驱动的GUS信号主要在成熟的花药和花粉中表达。qRT-PCR分析结果显示,BcPMEI85在花粉发育晚期的雄蕊中有高且特异的表达水平。At5G46940是BcPMEI85的同源基因。拟南芥芯片数据分析结果表明,At5G46940主要在成熟雄蕊和花粉中表达。通过反义RNA技术抑制BcPMEI85的表达后,与对照植株相比,转基因植株的花器官形态、花粉形态和花粉活力并未出现异常,表明可能存在其它的PMEI基因与BcPMEI85的功能冗余。