论文部分内容阅读
背景:人参被列为神农本草上品,通常被称为是滋补品,然而它药用也是很有价值的,例如抗炎抗癌。人参皂苷衍生物AD-1是提取于人参果浆,同样具有抗炎、抗肿瘤等多种药理功效。炎症性肠病（IBD）是一种慢性、非特异性的肠道炎症,黏膜免疫系统的各种成分与IBD的发病机制有关,包括肠上皮细胞和适应性细胞免疫系统及其分泌的介质。IBD中CD4+T细胞亚群可能在疾病中发挥重要作用,其中,Th1/Th2和Th17/Treg失衡被认为是IBD的主要原因。目的:明确基于CD4+T细胞免疫调节作用的新型人参皂苷衍生物AD-1对TNBS诱导的急性结肠炎模型的疗效。方法:将雌性C57BL/6小鼠共分为五组,分别是正常对照组（Control）、乙醇对照组（Ethanol）、模型组（TNBS）、AD-1治疗组（TNBS+AD-1）、5-氨基水杨酸阳性对照组（TNBS+5-asa）,Control组和Ethanol组各五只,TNBS组、TNBS+AD-1组和TNBS+5-asa组各10只。在第零天对TNBS组、TNBS+AD-1组和TNBS+5asa组给予2.5%TNBS乙醇溶液灌肠,对Control组给予生理盐水的灌肠,对Ethanol组给予25%乙醇溶液灌肠,灌肠后24h成模,在第一天开始TNBS+AD-1组和TNBS+5asa组灌胃给药,AD-1给药剂量10mg/kg,5-asa给药剂量30mg/kg,灌胃溶剂使用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）溶液,Control组、Ethanol组和TNBS组给予0.5%CMC溶液灌胃,持续四天,记录各组小鼠的体重及临床评分。在第五天处死全部小鼠前,取眼球血,分离血清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子干扰素（IFN）-γ、白介素（IL）-4、IL-17A、IL-10的细胞因子分泌的情况;处死后,分离脾脏和结肠,测量结肠长度,取部分结肠固定在甲醛溶液中,制成石蜡切片进行苏木素-伊红（HE）染色,切片染色后显微镜观察结肠组织病理学的变化;RT-PCR检测结肠中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-10的基因的表达水平;蛋白印迹法（WB）检测结肠中的转录因子T盒子转录蛋白（T-bet）、Gata结合蛋白3（Gata3）、维甲酸相关孤儿受体γt（ROR-γt）和叉头框蛋白P3（Foxp3）的表达水平;流式细胞术检测脾脏中CD4+T细胞亚群分化的百分率。结果:1.TNBS+AD-1与TNBS组相比明显改善了IBD小鼠体重下降、结肠长度缩短的问题,并且降低了小鼠DAI评分。2.HE染色结肠组织病理切片结果显示,TNBS组小鼠结肠黏膜损伤严重,隐窝结构被破坏,杯状细胞消失,大量炎性细胞浸润。而TNBS+AD-1组小鼠结肠黏膜结构较为完整,炎症细胞浸润减少,杯状细胞消失、隐窝结构的破坏等情况都有很大的改善。3.RT-PCR方法检测小鼠结肠组织中IFN-γ、IL-17A、IL-4和IL-10细胞因子基因的表达情况,与TNBS组相比,TNBS+AD-1组IFN-γ和IL-17A基因的表达明显降低（P＜0.05,P＜0.01）,IL-4和IL-10基因的表达显著升高（P＜0.01,P＜0.001）。4.WB方法检测小鼠结肠组织中T-bet、ROR-γt、Gata3和Foxp3的蛋白表达水平,与TNBS组相比,TNBS+AD-1组T-bet和ROR-γt的蛋白表达显著降低（P＜0.01）,且Gata3和Foxp3的蛋白表达显著增高（P＜0.05,P＜0.01）。5.ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ、IL-17A、IL-4和IL-10的细胞因子分泌情况,与TNBS组相比,TNBS+AD-1组小鼠血清中分泌的IFN-γ和IL-17A含量明显降低（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）,IL-4和IL-10含量增高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001）。6.流式细胞术检测Th1、Th2、Th17和Treg细胞的分化率,结果显示,与TNBS组相比,TNBS+AD-1组小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17A+T细胞分化率显著下调（P＜0.01,P＜0.001）,CD4+IL-4+和CD4+Foxp3+T细胞的分化率显著增高（P＜0.05,P＜0.001）。结论:1.人参皂苷衍生物AD-1可以缓解TNBS诱导的小鼠急性IBD。2.人参皂苷衍生物AD-1对IBD的治疗作用可能与调控Th1/Th2和Th17/Treg细胞的平衡有关。