研究背景和目的：　　高致病性禽流感病毒H5N1具有高发病率、高死亡率的特点。目前认为，机体感染禽流感病毒H5N1后，过度免疫应答反应引起“炎症级联瀑布效应”而致ALI/ARDS是引起高死亡率的主要原因。但是具体机制尚不清楚。呼吸道固有免疫系统是机体防御病原微生物的第一道防线。研究表明：机体通过模式识别受体（PRRs）识别病原微生物的病原相关分子模式（PAMPs），启动抵抗病原体的固有免疫应答，通过释放炎症因子、趋化因子等，募集免疫吞噬细胞到肺内，清除细胞内外入侵的病原体，这一炎症过程会引起组织细胞损伤。与此同时，机体也能启动免疫耐受机制控制炎症反应的程度，防止组织细胞损害。免疫耐受机制缺失或受到抑制可导致过度免疫应答而产生免疫病理性损伤。　　囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmenbrane conductance regulator CFTR）是一种环腺苷酸（cAMP）激活的ATP门控性氯离子（Cl-）通道。生理功能主要为氯离子跨上皮运动提供了选择性通道，对于跨上皮的盐类运输、液体流动和离子浓度调节等具有重要的决定作用。近年来研究表明：CFTR功能缺失，除了会引起呼吸道粘液层改变，导致病原微生物的清除受阻外，还会使固有免疫炎症的NF-κB信号通路基态下处于过度活化状态，提示其作为一种免疫炎症调节因子具有免疫耐受功能。我们实验室前期研究发现，高致病性禽流感病毒H5N1的血凝素蛋白(hemagglutinin HA)能够异常激活肺上皮不依赖干扰素的固有免疫JAK2,3/STATs、NF-κB信号通路，释放大量的促炎因子和趋化因子，如IP-10、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β and RENTES，导致严重的肺部炎症。控制细胞因子产生与功能门户的细胞浆酪氨酸激酶（Janus kinase JAK）家族的JAK3激酶是介导这一过程的决定子，选择性靶向JAK3不仅能下调相关的JAK/STAT信号，亦能抑制 NF-κB的转录激活，显著减轻了HA蛋白介导的免疫炎症损伤。这些观察提示：HA通过诱导JAK3异常激活可能同时干扰了呼吸上皮免疫炎症调节因子CFTR的负调控NF-κB转录的功能，抑制了机体的免疫耐受机制，加剧了免疫应答炎症反应，进而促进了免疫病理性损伤的发生。基于上述，本研究旨在于揭示禽流感病毒H5N1通过其表面糖蛋白启动异常固有免疫应答，激活JAK3可能介导的对上皮炎症调节子CFTR的影响及其内在关联机制，探索抗损伤的免疫耐受保护机制，为临床上防治流感病毒感染提供新的治疗策略，并对新药的研发奠定理论基础。　　研究内容和方法：　　第一部分：禽流感病毒H5N1 HA蛋白对CFTR表达与功能的影响及其与JAK3激活的关系。　　1.分别将B6129S4-Jak3tm1Ljb小鼠[JAK3(-/+)]，B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]随机分为空白对照组、HA（40μg/ml）组。分离小鼠气道，用短路电流方法，观察气道基顶膜给予HA蛋白刺激10min、20min后，基础短路电流的改变情况。　　2.将B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]随机分为 B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]对照组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]HA（1mg/ml）组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]HA（0.75mg/ml）组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]HA（0.5mg/ml）组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]Forsklin(10mg/kg)+HA(1mg/ml)组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]JAK3inhibitor(0.15mg/kg)+HA(1mg/ml)组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]Glibenclamide(10mg/kg)+HA(0.5mg/ml)组；和B6129S4-Jak3tm1Ljb小鼠[JAK3(+/-)]HA（1mg/ml）组。经小鼠气道给予不同剂量HA蛋白，各预处理组提前30分钟腹腔注射各药物，12h后，取肺脏组织观察病理改变。与此同时，免疫荧光方法检测小鼠气道表面CFTR表达变化。　　第二部分：HA蛋白抑制CFTR功能依赖的固有免疫应答模式识别受体信号转导机制　　1.HA（80μg/ml）蛋白刺激calu-3细胞6h、12h、24h，real-time quantitative-PCR的方法检测TLR4和CFTR的表达变化。不同浓度的HA蛋白刺激calu-3细胞12h，及给予Forskolin(10μm/ml)、Glibenclamide(200μm/ml)、JAK3抑制剂（760ng/ml），免疫荧光方法检测CFTR的表达变化和NF-κB的活化情况。　　2.HA（40μg/ml）蛋白刺激16HBE细胞0，15min，30min，60min，120min，Western Blotting方法观察p-JAK3的表达变化，及给予JAK3抑制剂后，对p-JAK表达的影响。HA（40μg/ml）蛋白刺激16HBE细胞12h后，收集培养上清，用液相芯片检测细胞上清液中炎症因子ICAM-1,IL-18,IP-10，MCP-1，MIP-3a，MMP-7表达变化，及给予JAK3抑制剂后对其表达的影响。HA（40μg/ml）蛋白刺激16HBE细胞30min，免疫荧光的方法观察p-JAK3的表达情况及给予 JAK3抑制剂对其表达影响。HA（40μg/ml）蛋白刺激16HBE细胞10min，20min，ELISA的方法检测细胞内AC和cAMP浓度变化及给予JAK3抑制剂对其的影响。　　3.1 mM IBMX刺激16HBE细胞15 min后给予Forskolin(FSK;10μM,)刺激30min，然后单独给予HA蛋白(40μg/ml)作用30min或是HA蛋白联合IL-2（100UI/ml,）共同作用30min。PTx组则给予PTx预处理16h，TLR4inh组和JAK3inh组则给予TLR4抑制剂或JAK3抑制剂预处理30min。裂解细胞检测细胞内cAMP的浓度，观察HA蛋白对抑制性G蛋白偶联受体的作用。　　4.短路电流的方法观察给予TLR4抑制剂和JAK3抑制剂预处理，再给予HA蛋白共同作用10min、20min，小鼠气道上皮CFTR通道活性的改变情况。　　结果：　　第一部分：禽流感病毒H5N1 HA蛋白诱导上皮CFTR抑制通过激活JAK3介导，选择性抑制JAK3或上调环腺甘酸及其依赖的CFTR表达，可以减轻HA介导的急性肺损伤。　　1.B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]气道给予HA蛋白刺激10min、20min后，显著抑制CFTR的功能。在B6129S4-Jak3tm1Ljb小鼠[JAK3(-/+)]组没有观察到类似现象。　　2.B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]经气道给予HA12h后，光镜下与正常对照比相比，表现为弥漫性肺泡损伤。而B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]Forsklin(10mg/kg)+HA(1mg/ml)组；B6129SF2/J小鼠[JAK3(+/+)]JAK3inhibitor(0.15mg/kg)+HA(1mg/ml)组和 B6129S4-Jak3tm1Ljb小鼠[JAK3(+/-)]HA（1mg/kg）组肺损伤程度明显减轻。HA蛋白（0.75mg/kg）组和HA蛋白（0.5mg/kg）组与HA蛋白（1mg/kg）组相比，损伤程度有所减轻，但联合腹腔注射Glibenclamide（10mg/kg），肺脏同样出现严重的弥漫性肺泡损伤。　　第二部分：HA蛋白通过TLR4/JAK3信号通路阻碍CFTR功能，进而介导严重的固有免疫炎症反应。　　1.HA（80μg/ml）蛋白刺激calu-3细胞12h后，TLR4显著上调并随时间延长，持续升高。而CFTR在12h，显著下调。HA（80μg/ml）蛋白刺激calu-3细胞12h，CFTR表达下调，NF-κB显著活化。给予JAK3抑制剂和 Forsklin干预后，可以逆转HA蛋白引起的CFTR的下调和NF-κB的活化。预处理Glibenclamide30min再分别给予HA蛋白（40μg/ml）和HA蛋白（20μg/ml）共同刺激 calu-3细胞12h，与单纯给予 HA蛋白（40μg/ml）和 HA蛋白（20μg/ml）12h比较，CFTR的显著下调，NF-κB的活化明显增加。　　2.HA（40ug/ml）蛋白刺激16HBE细胞不同时间，Western Blotting观察到p-JAK3随时间显著上调，给予 TLR4抑制剂以后，显著下调。给 JAK3抑制剂后，得到类似的结果。免疫荧光实验也观察到类似的结果。HA（40μg/ml）蛋白刺激16HBE细胞12h，细胞上清液中ICAM-1、IP-10、IL-18、MCP-1、MIP-3、MMP-7表达显著升高。给予JAK3抑制剂预处理，显著下调上述各炎症因子。HA（40μg/ml）蛋白刺激16HBE细胞不同时间，显著降低细胞内AC和cAMP的浓度，给予JAK3抑制剂预处理后，细胞内AC和cAMP的浓度显著升高。　　3.HA蛋白单独刺激16HBE细胞30min后，细胞内cAMP的浓度与FSK组比较显著下降；给予抑制性G蛋白偶联受体PTx预处理16h后，再给与HA蛋白刺激，细胞内的cAMP的浓度较单独给予HA组显著升高。如果给予JAK3抑制剂预处理30min，再给予HA蛋白作用，与单独给予HA蛋白作用比较细胞内cAMP的浓度也显著升高。同时，如果给予PTx预处理16h后给予HA和IL-2同时作用30min，细胞内cAMP的浓度与预处理PTx后单独给予HA蛋白比较显著下降。　　4.给予TLR4抑制剂后，可以显著上调由HA引起的CFTR的下调。给予JAK3抑制剂处理后，得到类似的结果。　　结论：　　1.禽流感病毒H5N1 HA蛋白经细胞表面模式识别受体TLR4致敏激活胞浆JAK3酪氨酸激酶，抑制了气道上皮cAMP依赖的CFTR通道的炎症调节功能，使NF-κB信号通路过度活化，导致了过强的固有免疫炎症反应。　　2.H5N1 HA蛋白介导激活的TLR4/JAK3信号激活了抑制性G蛋白偶联受体，从而抑制了腺苷酸环化酶活性，致使cAMP生成障碍，进而干扰了cAMP依赖的CFTR通道功能。　　3.选择性抑制JAK3与提高cAMP的水平及其依赖的功能CFTR通道表达，均能有效抑制禽流感病毒H5N1 HA蛋白引起的过度炎症反应，提示选择性抑制JAK3或激活cAMP依赖的CFTR通道，在防止免疫损伤增强免疫耐受，对抗禽流感病毒引起的急性致死性肺损伤的治疗方面具有广泛的应用前景。