多发性骨软骨瘤(Multiple Osteochondroma,MO)属于一种骨胳发育异常疾病,在患者的骨胳上可观察到大小不等的骨隆起。该病为常染色体显性遗传疾病,患者多在青少年时期发病,且大部分的患者有家族遗传史。该肿瘤可干扰正常骨骺的生长导致骨骼畸形。患者大多身材矮小、肢体力线异常以及功能障碍。MO一个显著的特征是有一形似帽子的软骨层(即软骨帽)位于瘤体的顶部。软骨帽可以通过其深层的软骨化骨作用促使MO不断增生,瘤体体积增大可以导致病人局部疼痛,甚至可能引起骨骼畸形,因而引起运动功能障碍或使邻近的血管神经受压导致相应病变。另外,急速的瘤体增生是该病恶变的征兆。目前,针对多发性骨软骨瘤的药物仍处于研发阶段,MO的治疗还主要依赖手术。MO的手术治疗主要有瘤体切除和为改善外观畸形和肢体功能的矫形等。近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展,人们从微观领域对MO的研究和认识也越来越多,对其发病机制的研究也逐步深入。MO病理解剖后,可见MO呈菜花状,由软骨膜、软骨帽和骨性瘤体组成。软骨膜作为软骨重要组成部分,软骨膜由两层组成,其中外层中有相对比较致密的胶原纤维,其对软骨主要起保护作用;而内侧的纤维较疏松,但是细胞数量相对较多,其中的一些梭形小细胞为骨原细胞,其可增殖分化为软骨细胞,因而其与软骨的生长有密切的关系,目前对其在软骨瘤患者中发生的病理变化研究甚少。分子生物学研究显示,有多种细胞因子在骨骼形成过程中发挥着重要的作用。Sox9(Sex Determining Region Y Box Protein 9)是软骨形成过程中重要的转录因子,该基因开启后可促使间充质干细胞分化为软骨细胞。软骨形成早期,Sox9在间充质干细胞的定向分化聚集过程发挥重要作用。另外,有研究发现,Osterix基因与成骨细胞分化和骨骼形成关系紧密,并且Osterix能调节众多成骨因子的表达,从而合成基质,发生矿化反应,最终实现骨的形成。本研究首先通过扫描电镜和透射电镜观察了MO软骨帽及软骨膜的超微结构,使人们对MO的超微病理结构有更多的了解,为探索MO的发病机制提供参考,更有利于提高MO超微病理诊断。我们又观察了Sox9和Osterix两个基因在骨软骨瘤组织标本和骨软骨瘤组织外周血血清中的表达量,并对两基因进行了相关性分析,旨在探索多发性骨软骨瘤可能的发病机理。本课题包括以下三部分:1.多发性骨软骨瘤软骨帽超微结构的观察;2.多发性骨软骨瘤软骨膜超微结构的观察;3.多发性骨软骨瘤分子机制研究。第一部分多发性骨软骨瘤软骨帽超微结构的观察方法1.标本选取,MO组:手术切除的瘤体并经病理检查确诊的MO患者的骨软骨瘤组织标本30例;对照组:行髋脱位截骨术后残余的髂骨翼骨软骨的组织标本30例。2.扫描电镜观察正常软骨组织和MO患者骨软骨瘤的软骨帽标本。3.透射电镜观察正常软骨组织和MO患者骨软骨瘤的软骨帽标本。结果1.正常软骨组织和MO患者骨软骨瘤的软骨帽标本扫描电镜观察结果对照组(正常髂骨翼骨软骨组织):在软骨陷窝内可以看到有较少的软骨细胞存在,这些细胞的主要形状有圆形或不规则形,在软骨细胞表面上发现有较少的突起,此外,有较多散状排列、密度较稀疏的胶原纤维附于软骨陷窝周围。MO组(MO患者骨软骨瘤软骨帽):有较多形状不一的软骨陷窝存在于软骨组织中,且与对照相比,陷窝内有大量的体积较大的软骨细胞,这些软骨细胞的主要特征是形状不规则,细胞表面突起丰富,结构较致密的胶原纤维存在于软骨陷窝周围。2.正常软骨组织和MO患者骨软骨瘤的软骨帽标本透射电镜观察结果对照组(正常髂骨翼骨软骨组织):可见少量的软骨细胞,大多数的细胞为椭圆形,细胞表面有较少的微绒毛;细胞核形状大多呈现不规则状,细胞核内染色质边缘有凝集;细胞质内的细胞器较少,有呈条索状分布的粗面内质网,一些粗面内质网膜上有核糖体颗粒分布;线粒体的形状为圆形,且体积比较小;细胞质内还发现有簇状分布的糖原颗粒。MO组(MO患者骨软骨瘤软骨帽):软骨细胞数量多,体积大,呈梭形,细胞核的体积增长且形状为圆形;在细胞核内可见丰富的染色质及清楚的核仁,细胞的核质比升高;线粒体数量较少,线粒体呈圆形或椭圆形;有大量的粗面内质网出现,这些粗面内质网呈现扩张状态,有低电子密度物质沉积于此;在细胞内溶酶体较少;游离核糖体常可见到;细胞间亦有蛋白样物质的沉积。第二部分多发性骨软骨瘤软骨膜超微结构的观察方法1.标本选取,MO组:手术切除的瘤体并经病理检查确诊的MO患者的骨软骨瘤组织标本30例;对照组:行髋脱位截骨术后残余的髂骨翼骨软骨的组织标本30例。2.扫描电镜观察正常组织软骨膜和MO患者骨软骨瘤软骨膜标本。3.透射电镜观察正常组织软骨膜和MO患者骨软骨瘤软骨膜标本。结果1.正常组织软骨膜和MO患者骨软骨瘤软骨膜标本扫描电镜观察结果对照组(正常组织软骨膜):有大量胶原纤维存在,且其排列疏松呈束状。MO组(MO患者骨软骨瘤软骨膜):有大量胶原纤维存在,并呈密集排列,但其排列不规则,呈簇状。对照组(正常组织软骨膜):成纤维细胞结构完整,呈梭形或不规则状,成纤维细胞无突起、无细胞分泌现象;核仁体积较小,呈圆形或椭圆形,核内染色质凝集;粗面内质网较丰富,线粒体无明显增大增粗现象;细胞质内未见胶原蛋白;软骨膜中可见大量胶原纤维密集交错排列;成纤维细胞周围未见胶原微纤微分泌及毛细血管形成。MO组(MO患者骨软骨瘤软骨膜):成纤维细胞呈圆形或椭圆形,周围分泌大量细丝状胶原微纤维,在成纤维细胞周围呈局部密集状分布;细胞核体积较大,呈圆形,核内常染色质较丰富;粗面内质网异常丰富且呈轻度扩张状态,线粒体轻度增大增粗;细胞质内见大量的均质胶原蛋白,电子密度低;软骨膜中胶原纤维丰富,呈密集交错状,局部可见新生毛细血管或血管闭锁。2.正常软骨膜和MO患者骨软骨瘤软骨膜标本透射电镜观察结果第三部分多发性骨软骨瘤分子机制研究方法1.免疫组织化学染色法检测Sox9和Osterix在正常软骨组织和骨软骨瘤组织中的表达情况。2.MO患者骨软骨瘤组织标本中Sox9和Osterix表达的相关性分析。3.ELISA方法检测对照组和MO组外周血清中Sox9和Osterix的表达情况。4.MO患者外周血清中Sox9和Osterix浓度的相关性分析。5.q RT-PCR检测正常软骨组织和骨软骨瘤组织中Sox9和Osterix m RNA的表达情况。6.MO组软骨组织标本中,分析在m RNA水平上Sox9与Osterix之间的相关性。7.Western blot检测Sox9和0sterix蛋白在MO骨软骨瘤组织和正常软骨组织中的表达情况。8.分析MO组织及正常髂骨脊骨软骨组织软骨膜及软骨帽中胶原纤维和毛细血管的形态与Sox9和Osterix蛋白表达的关系。结果1.免疫组织化学染色发现,Sox9和Osterix蛋白在对照组和MO组软骨标本中均有不同程度的阳性表达,但在MO组软骨组织标本中的表达水平明显高于对照组。2.统计分析发现,MO组软骨组织标本中Sox9与Osterix的表达水平之间呈正相关关系。3.ELISA方法检测结果显示,Sox9和Osterix在MO组外周血中的浓度水平明显高于对照组。4.MO患者外周血清中Sox9和Osterix浓度呈正相关关系。5.q RT-PCR检测结果显示,Sox9和Osterix在MO组软骨组织标本中的表达水平明显高于对照组。6.q RT-PCR检测结果显示,MO组软骨组织标本中Sox9与Osterix m RNA的表达水平之间呈正相关性。7.Western blot检测结果显示,Sox9和Osterix蛋白在MO组软骨组织标本中的表达水平明显高于对照组。8.骨软骨瘤内的毛细血管生成和胶原纤维的形成可能与Sox9和Osterix蛋白表达有关。结论1.与正常的软骨组织相比,MO患者骨软骨瘤软骨帽的超微结构发生了明显改变,MO患者骨软骨瘤软骨帽中的软骨组织代谢异常的旺盛,细胞生长及蛋白质合成明显升高,MO软骨帽中的胶原纤维变得致密并有钙化倾向,促进了骨软骨瘤的发生发展及恶变。2.与正常的软骨组织相比,MO患者骨软骨瘤软骨膜的超微结构发生了显著变化,提示MO患者骨软骨瘤软骨膜中的软骨组织代谢活动异常的活跃,并且软骨细胞增殖及蛋白质合成等生命活动加快,部分的软骨膜中胶原纤维丰富,推测其可能也为骨软骨瘤的形成及恶变提供了一定的物质基础。3.在MO患者骨软骨瘤瘤体组织及外周血清中Sox9和Osterix的m RNA和蛋白水平的表达显著高于对照组,而且两者之间具有一定的正相关性。4.Sox9和Osterix的表达可能促进MO组织中胶原纤维和毛细血管的形成。