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【目的】本研究旨在构建一种装载有骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell,BMSC)和脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)的3D打印多功能水凝胶支架系统,测定其空间结构和药物释放等指标,并通过细胞毒性实验和功能测定评价其对动物体内实验的安全性,为将来在动物体内应用水凝胶支架修复脊髓损伤提供理论基础。【方法】1.3D打印水凝胶支架的制备与性质测定将10% GelMA水凝胶及BMSC和LAP交联剂配置成打印墨水,利3D生物打印机打印出具有一定形状的含有BMSC的水凝胶支架,打印24h后,在扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)下观察支架及细胞形态。缓释性能测试:每个支架中BDNF起始浓度为0.5μg,每天加PBS换液一次,分别收集不同时间点PBS溶液,待全部样品收集完成后ELISA试剂盒检测各时间点各样品BDNF释放量。2.水凝胶支架系统的生物相容性分析水凝胶支架制备完成24h后,将2D培养基组、3D打印支架组样本预处理。采用Calcein AM-PI染色试剂盒检测打印后各组细胞存活率,并用激光共聚焦显微镜观察、拍照。用同样的方法,采用CCK8检测试剂盒测试支架打印后1天、4天、7天、14天细胞增殖情况。3.3D打印水凝胶系统的功能测定水凝胶支架制备完成7天后,将2D、3D培养的细胞样品中分别加入1000μLTrizol,细胞充分裂解后,加入30μl RNA-free water溶解RNA,取1μl总RNA测OD260定量。在1.5ml的离心管中加入RNA、RNA酶抑制剂(50U/μl)以及引物(50p M/μl)等行m RNA逆转录,在一定条件下PCR扩增并采用q PCR检测CD29、CD44、CD73、CD166 m RNA含量的变化。【结果】1.BMSC细胞与GelMA水凝胶配置成生物打印墨水,利用3D生物打印技术成功打印出水凝胶支架。通过SEM观察,可以清晰地看到其多孔的三维立体网状结构,BMSC均匀地分布在支架各部生长。在3D打印水凝胶支架系统中,第1天BDNF释放量最多,在1周内缓释能力逐步达到稳定,第2-4周仍保持生物活性剂量的BDNF释放。2.细胞活死染色结果显示,在支架打印24h之后,BMSC细胞在2D培养基和3D水凝胶支架中均生存良好。高倍视野下可以清晰地看到,2D培养基中细胞呈长梭形分布,细胞排列紧密,部分相互接触。而3D支架内细胞活体细胞随支架结构呈有序排列,均匀地分散在支架内部和表面,每个视野中细胞密度相对较低,但经过每个视野逐层叠加,图像合成后其总数多于2D组。细胞毒性实验中,2D组细胞在第4天较第1天有所增长,但在第7天和第14天时,细胞活力下降;而在3D支架中,细胞呈持续增长趋势。整体来看,BMSC细胞分别在1天、4天、7天及14天实验组均较对照组中存活率高,两者比较差异有统计学意义(P<0.05),证明3D生物打印水凝胶支架较2D培养基毒性低,安全性高,细胞增殖性更强。3.2D、3D培养的BMSC细胞表面均可以表达一定量的CD29、CD44、CD73、CD166。其中3D水凝胶支架组细胞在CD29的表达量上小于2D组,差异具有统计学上的意义(P<0.05);在CD44、CD73、CD166的表达量上,各组间无显著差异(P>0.05)。【结论】1.本实验成功制备了具有多孔性、缓释性、细胞分布均一性等优良特性多功能3D生物打印水凝胶支架。该支架系统安全性高,细胞增殖性强,具有良好的生物相容性。2.3D打印水凝胶支架可以通过降低CD29的表达使骨髓间充质干细胞迁移能力下降,使细胞更好地聚集在支架孔径内部,减少向支架外环境迁移几率,更好地促进轴突地生长。3.细胞因子在水凝胶支架系统内随着时间不断地释放,诱导BMSC功能和位置的改变,提高细胞向神经元方向分化的数量,提升了轴突再生效率,从而为体内多重机制联合修复脊髓损伤奠定了基础。