目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和2型糖尿病(T2DM)是两种常见疾病,临床上两者常常共存,并通过协同作用引发不良预后。NAFLD和T2DM共存时增加了发生糖尿病并发症的风险(包括宏观和微观血管并发症),同时也会促进NAFLD的病程进展,导致肝硬化、肝细胞性肝癌甚至死亡。肝脏作为全身代谢的关键器官,对胰岛素抵抗和2型糖尿病的形成起着重要作用,其形成过程涉及肝脏脂肪堆积、能量代谢的改变和来自包括免疫细胞在内的各种细胞类型的炎症信号,目前这些过程背后的机制尚不完全清楚。铁死亡是一种调节性细胞死亡形式,由GPX4的失活和活性氧积累所导致。这种呈铁依赖性的细胞死亡在形态学、生物化学和遗传学上有别于凋亡、坏死等其他细胞死亡形式。铁螯合剂和一些与去除过氧化脂质相关的基因如胱氨酸/谷氨酸转运蛋白(x CT)和谷胱甘肽过氧化物酶蛋白4(GPX4)参与了抑制铁死亡的过程。目前已有研究提出糖尿病患者体内的高糖状态会对铁代谢产生影响,2型糖尿病患者铁蛋白水平普遍呈升高趋势。而高糖状态能否影响NAFLD患者肝脏铁代谢及其作用机制,目前尚不明确。因此,研究铁死亡途径是否参与高糖诱导的脂肪变性肝细胞损伤具有重要意义。方法:1.应用棕榈酸(PA)干预建立L02细胞脂肪变性模型;2.应用CCK-8检测法分别检测PA和高糖联合PA干预对L02细胞活性的影响,以及铁死亡抑制剂FER-1对不同干预组细胞活性的作用;3.检测细胞内铁离子浓度和转铁蛋白Tf R1 m RNA和蛋白水平相对表达量,明确PA和高糖联合PA干预对L02细胞内铁代谢的影响,并进一步检测FER-1对干预后细胞内铁代谢的作用;4.GSH试剂盒检测不同干预条件下L02细胞谷胱甘肽含量,MDA试剂盒检测L02细胞内脂质过氧化的情况;5.RT-PCR法和Western Blotting法检测不同干预组细胞内GPX4、x CT m RNA和蛋白水平相对表达量,明确GSH上下通路相关因子是否参与高糖诱导的脂肪变性肝细胞损伤;6.ROS免疫荧光染色检测不同干预对L02细胞内活性氧积累的影响;7.RT-PCR法检测高糖和FER-1对脂肪变性肝细胞内TNFα、IL-6、IL-1β等促炎细胞因子相对表达量影响。结果:1.建立L02脂肪变性模型后,油红染色镜下可见PA干预后细胞内红色脂滴形成,而高糖联合PA干预后细胞内脂滴数量明显增多。检测不同干预下细胞内甘油三酯(TG)含量,PA干预后细胞内TG含量增高,GLU+PA组细胞内TG含量较PA组也有显著增高。提示高糖可以促进肝细胞内甘油三酯累积和脂滴形成。2.CCK-8法检测发现,PA干预L02细胞使细胞活性下降,加入FER-1不能抑制细胞死亡;GLU+PA干预组较单纯PA干预组细胞活性降低更加明显,加入FER-1可以抑制部分细胞死亡,这说明FER-1可以一定程度上抑制高糖所致的脂肪变性肝细胞损伤。3.高糖干预下的脂肪变性肝细胞内铁离子水平和转铁蛋白Tf R1表达量均有显著增高。4.GLU+PA组细胞较PA组细胞MDA含量增多,GSH含量减低,结果有统计学意义。5.高糖诱导脂肪变性肝细胞损伤过程中,在基因和蛋白水平铁死亡相关因子GPX4、x CT均表现出相对表达量降低。6.免疫荧光结果显示,高糖干预可以促进脂肪变性肝细内ROS累积。7.RT-PCR检测基因水平上,高糖促进脂肪变性肝细胞内促炎细胞因子TNFα、IL-6、IL-1β表达增高,加入铁死亡抑制剂FER-1后相对表达量一定程度降低。结论:研究结果显示,在体外实验中,单纯棕榈酸干预不能诱导肝细胞出现铁死亡,而高糖干预下脂肪变性肝细胞表现出铁过载、GPX4、x CT表达降低、GSH耗竭和ROS累积等铁死亡特征性变化并且可以被铁死亡抑制剂FER-1所抑制,提示高糖可能通过铁死亡途径诱导脂肪变性肝细胞损伤。TNFα、IL-6、IL-1β等促炎细胞因子在高糖状态下高表达,加入铁死亡抑制剂后可被显著抑制,提示了铁死亡可能参与了高糖诱导细胞炎性反应过程。铁死亡途径在糖尿病合并NAFLD的发病机制中具有重要作用,未来有希望成为其预防和治疗的靶点。