膀胱癌为泌尿系统最常见的肿瘤，在西方是第5位常见的肿瘤，占所有癌症患者的4％，在癌症致死的患者中占2％。据估计，在2000年美国有31200人诊断为膀胱癌，12200人死于此病。膀胱癌的复发性和浸润性是影响治疗预后的主要原因。 随着分子生物学的发展及其在肿瘤中的应用，现认为肿瘤发生机制主要是原癌基因的激活和抑癌基因的失活导致细胞增殖失控及凋亡缺陷，所以，肿瘤被视为一种基因疾病。纠正肿瘤细胞中异常基因的行为，抑制癌基因的过度表达，增强抑癌基因的功能，将从分子水平治疗肿瘤。 近年来的研究表明，膀胱癌有染色体的遗传学改变，等位基因缺失常见于4p，8p，9p，9q，10q，11p和17p等，已经确认p53和p16为抑癌基因。最近，在肿瘤中同源性缺失的10q23.3位基因被克隆出来，被命名为PTEN。这个基因具有如下特点：1．在多种高分级癌中有突变。2．具有磷酸酶活性，与张力蛋白同源。3．在上皮细胞内富含且能被TGF-β调控。研究发现，PTEN在多种肿瘤中有突变和缺失，包括恶性黑色素瘤、脑肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌和头颈肿瘤等。PTEN被认为是一种新的抑癌基因，它具有双特异磷酸酶活性，能使作用底物的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸去磷酸化，调控细胞内信号传导通路。PTEN能够调控很多细胞的生长、粘附、迁移、浸润和凋亡等。PTEN在膀胱癌的研究目前刚刚开始，国外仅有PTEN在膀胱癌突变的报道，国内还无人涉及。 天津医科大学博士学位抢文 本课题用外源性野生型PTEN(wT一PTEN)、突变型pTEN(DN一PTEN)质粒对膀肤癌细胞系EJ进行转染，达到基因治疗的目的，初步研究了PTEN基因对膀肤肿瘤细胞生物学的影响，并将基因治疗与化学治疗联合治疗肿瘤，探讨了其临床应用价值。通过检测膀肤肿瘤组织中PTEN第5外显子、第8外显子的突变，证明了PTEN突变在膀肤癌中不是一个常见事件。通过检测膀耽肿瘤组织中PTEN、Bcl一2的表达，研究了PTEN、Bcl一2在膀肤癌的表达特点。本课题的完成，较为系统地研究了PTEN基因在膀胧癌细胞的独特作用，为以PTEN进行膀肤癌的基因治疗奠定了基础。第一部分WT一PTEN对膀肤癌细胞生物学行为影响的研究 实验采用含有磷酸酶活性的wT一PTEN一cDNA质粒PsvEGFP一PTEN、磷酸酶灭活的pTEN突变体psvEGFp一C124A质粒及psvEGFP空载质粒，这三种质粒均没有抗生素抗性。另一个质粒为p一IRSE一Ve以or空载质粒含Amp和Hyg抗性。这四个质粒经过体外扩增并纯化，用脂质体转染法，利用脂质体LipofeetAMIN分别将p一IRSE一Veetor与psvEGFp一pTEN、psvEGFp一C124A、PSvEGFP共转染人膀肤癌细胞系EJ中，经Hyg筛选出有绿色荧光的阳性细胞克隆，将其命名为EJ一psvEGFp一pTEN(WT一pl’EN)、EJ一psvEGFP一e一24A(DN一PTEN)、EJ一psvEGFp(VEC)。通过免疫组化检测细胞浆pTEN蛋白的免疫原性和Westcm blot方法检测细胞克隆的PTEN蛋白水平，发现EJ一psvEGFP一PTEN、EJ一psvEGFp一C124A增加了pTEN蛋白水平表达，EJ一psvEGFp没有变化，证明psvEGFp一pTEN、psvEGFp一C124A质粒在EJ细胞内有效表达。 通过观察EJ一psvEGFp一pTEN、EJ一psvEGFP一C 1 24A、EJ一psvEGFp和EJ细胞的生长情况，发现转染wT一PTEN的EJ一psvEGFP一PTEN的生长速度减慢，第6天时，下降了42.7%(P<0.01)，而转染突变体和空载体的细胞和对照组EJ细胞生长速率无明显差别(均P>0.05)。以MTT法检测细胞增殖率，发现 天津医科大学博士学位论文第2天开始转染外源性WT一PTEN基因的细胞克隆生存活力明显低于对照空载体组、EJ和EJ一psvEGFp一C124A组(均p<0.01)，EJ一psvEGFp一C一24A组增殖活力没有减低。第6天wT一PTEN组的细胞克隆生存活力下降了40.11% (与转染空载组相比)。说明PTEN能够减慢肿瘤细胞的生长速度。 通过流式细胞仪检测细胞周期时相结果显示，wT一PTEN基因转染的EJ一psvEGFp一pTEN细胞GO/GI比例高于EJ一psvEGFp一C124A、EJ一psvEoFP和EJ细胞，而S期细胞比例低于其它细胞。WT一PTEN表达载体抑制EJ细胞增殖的作用表现为，引起GI*S期阻滞，细胞停滞于GI期，从而抑制细胞的生长，显示了较好的抗肿瘤作用。WT一PTEN抑制细胞生长的作用机制，可能与对PI3玲Akt信号转导通路有关。 在光学显微镜下观察到EJ一psvEGFP一PTEN(与Ej细胞相比)细胞体积变小，细胞大小比较一致，异型性低。在透射电镜下，EJ一psvEGFP一PTEN组细胞可看到明确的凋亡及凋亡小体。EJ一psvEGFP一C124A组细胞可以看到浸润力强的癌细胞，看不到核DNA溶解及使癌细胞凋亡的作用。EJ一psvEGFP组与EJ组癌细胞形态上类似，均看不到核DAN溶解及细胞凋亡。表明wT一PTEN质粒转染EJ后，细胞核DNA受到破坏、溶解，增加了癌细胞凋亡，显然有明显抗癌作用。 Boyden ehamber体外浸润实验结果显示:EJ一psvEGFp一pTEN组细胞穿过Matrigel胶的细胞数少于EJ一psvEGFp一C 1 24A、EJ一psvEGFp、EJ的细胞数 (均P<0