猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)又名“蓝耳病”。是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种接触性传染病。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。其病原具有典型的嗜单核细胞/巨噬细胞特性,在体内,PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages, PAM),在体外,主要感染非洲绿猴肾细胞系MA-104及其衍生物Marc-145。PRRSV感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异受体结合,利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。至今,已报道了四个独立但功能相关的PRRSV细胞受体。唾液酸粘附素(Sialoadhesin, Sn)、似肝磷脂蛋白(Heparan sulphate, HS)、波形蛋白(Vimentin)和清道夫受体(CD163)。研究发现HS主要作用是吸附PRRSV到PAM细胞上,Sn则介导病毒的内吞,CD163可能协助Sn内吞,病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用。我们导师周恩民教授通过免疫共沉淀用单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2(Mab2-5G2:针对抗GP5抗体)在猪肺泡巨噬细胞和Marc-145中提取到一个分子量约为230kD的蛋白质,可能是PRRSV的一个新的受体,经质谱分析和测序确定为非肌肉肌球蛋白ⅡA(Non-myscle myosinⅡA,NMHCⅡA)。在动物体内,非肌肉肌球蛋白Ⅱ有三种异构体:ⅡA,ⅡB,ⅡC。此蛋白广泛分布在整个生物体内,在细胞的吸附,迁移和胞质分裂中发挥重要的作用。可溶性CD163与非肌肉肌球蛋白重链A型存在着相互作用,但是,迄今为止CD163受体参与病毒结合的部位,病毒上参与受体结合的蛋白及其结合部位,受体与受体之间的关系以及CD163受体与我们发现的新蛋白非肌肉肌球蛋白的结合部位还不得而知。为确定CD163受体在PRRS病毒侵染过程中的作用以及与非肌肉肌球蛋白之间的关系,本实验分别从猪肺泡巨噬细胞(PAM)和非洲绿猴肾细胞(Marc-145)中经RT-PCR扩增出编码CD163受体的全长基因,并克隆到pcDNA3.1/V5-His A载体中,得到表达CD163受体的真核表达载体。猪肾PK-15细胞和幼仓鼠肾细胞BHK-21为PRRSV非易感细胞系,将表达载体转染PK-15和BHK-21细胞后接种PRRSV,然后利用PRRSV的核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测病毒的情况。结果发现表达CD163蛋白的PK-15细胞/BHK-21细胞能够感染PRRSV。并且发现,CD163在PK-15和BHK-21细胞中的转染效率是有很大差别的,CD163在BHK-21中的转染效率约为10%,而在PK-15中的转染效率约为30%。在此基础上,共转染全长的CD163和真核表达的非肌肉肌球蛋白ⅡA羧基端330AA的蛋白PRA于非易感细胞系BHK-21,按100TCID50接PRRSV-12#,通过间接免疫荧光实验发现病毒感染量增加。以上实验结果显示CD163和PRA在PRRSV感染过程中可能起协同作用;为了证明NMHCⅡA与PRRSV的关系,Marc-145细胞被PRRSV感染,并在不同时间内固定,通过共聚焦显微镜发现,PRRSV在4℃时,主要吸附在细胞的表面,转入37℃后,大约5min,开始进入细胞内部,随着时间的延长,病毒进入细胞,则发现NMHCⅡA的表达量增多,在60min时PRRSV完全进入细胞,NMHCⅡA的表达量也开始减少。上述实验揭示,NMHCⅡA可能与PRRSV感染细胞有关。使用Scanprosite软件分别对猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞的CD163蛋白结构和功能域进行预测。CD163有1个信号肽和9个SRCR结构域(Scavenger receptor cystein-rich domain),在SRCR 6和SRCR 7之间有一个富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸(proline-serine-threonine,PST)区域。第二个PST区域则与SRCR 9相连。在CD163的羧基端含有一个跨膜区和一个短的胞质尾部。对于PAM,全长的CD163有1115个氨基酸组成,SRCR 1-9在CD163中的位置分别是54AA-151AA,161AA-258AA,268AA-365AA,375AA-472AA,480AA-577AA,585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA,931AA-1028AA;第一个PST区域所在的位置是683AA-720AA;第二个PST以及胞质尾部在1029AA-1115AA之间。对于Marc-145细胞的CD163,还没有人报道其全长序列,根据Vero细胞和PAM的CD163核苷酸序列的高度同源性,设计引物,经RT-PCR扩增出其全长序列是1117个氨基酸,首次在GenBank上注册,其基因序列号是JF753553。其SRCR 1-9在CD163中的位置分别是54AA-152AA,162AA-259AA,269AA-366AA,376AA-473AA,481AA-578AA,586AA-683AA,722AA-819AA,831AA-926AA,932AA-1029AA。第一个PST位置是684AA-721AA;第二个PST以及胞质尾部在1030AA-1116AA之间。通过SignalP信号预测软件预测知CD163氨基端1-16个核苷酸是信号肽,它指导着CD163的跨膜转移。根据CD163基因的结构特征以及相关的文献,本实验进一步将PAM和Marc-145细胞中的CD163受体基因各分割成3段。根据其来源不同将PAM中的CD163片段命名为P1,P2,P3; Marc-145细胞中的CD163片段命名为M1,M2,M3。经RT-PCR将各个片段克隆到PMD18-T载体,并将各个片段分别构建于真核表达载体pcDNA3.1/v5-His A和pEGFP-N1中。命名为Z-P1,Z-P2,Z-P3;Z-M1,Z-M2,Z-M3。Z-P1(798bp),在全长中的位置1-798bp;Z-P2在790bp-2046bp之间,共1257bp;Z-P3是2023bp-3345bp(1323bp);Z-M1含有777bp从1bp-777bp;M-2则从763bp-2049bp,共为1287bp;M3是1317bp,从CD163全长的2035bp到3351bp。分别将它们转染非易感细胞系BHK-21和PK-15,并对转染条件进行优化。结果发现P3和M3转染效率最高,P2,M2次之,P1,M1最低。同时,发现短片段的CD163在BHK-21细胞中的转染效率比在PK-15中的高。转染的细胞接入PRRSV后,通过PRRSV的N蛋白单克隆抗体,发现转染P1,M1的非易感细胞并不被PRRSV感染,而P2,M2和P3,M3则能够被病毒感染,并且发现转染P2,M2的非易感细胞病毒感染量要强于P3,M3。说明CD163的SRCR1-2并不参与病毒的感染,SRCR4-6对PRRSV复制起主要作用。为了进一步研究CD163在病毒感染中的作用以及PRRSV受体与受体、受体与PRRSV的蛋白、受体与非肌肉肌球蛋白(ⅡA,ⅡB)之间的关系,将分段的CD163片段进行原核表达。通过稀有密码子Graphical codon analysis分析软件,发现CD163序列中含有很多的稀有密码子,不利于蛋白的表达,为了蛋白表达,将P1,M1,P3,M3基因进一步的截短,截短的基因分别命名为Y-P1,Y-M1,Y-P3,Y-M3。其大小分别变为639bp,618bp,942bp和978bp,在CD163中的原位置依次变为160bp-798bp,160bp-777bp,2143bp-3084bp和2143bp-3120bp。将构建的重组质粒pET-28a-Y-(P1,P2,P3,M1,M2,M3)测序检测没有移码和突变,转入Rosetta感受态细胞并进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白大小分别约为24KD,46KD,35KD,22KD,46KD和36kD,与预期的结果相吻合。经Western-blot检测,所获得的各段重组蛋白均能与抗His-单克隆抗体发生特异性反应。将纯化的重组蛋白分别免疫Balb/c小鼠,三免后,获得高免的小鼠血清。根据血清病毒阻断实验,发现Y-P3和Y-M3小鼠血清在1/20和1/40的时候,能够阻断病毒感染,而Y-P2和Y-M2不仅没有阻断反而稍微增强,而Y-P1和Y-P2则与对照没有明显的区别;蛋白结合实验,发现纯化复性的CD163片段能够与Marc-145结合,通过荧光强度和细胞数量,证明在200μg/ml的条件下P1和M3结合最弱。蛋白结合实验证明CD163各片段可能结合Marc-145细胞上的某蛋白;为了证明CD163片段与NMHCⅡA的关系,通过免疫共沉淀技术以及Western Blot实验,发现M1和M3能够结合NMHCⅡA;在原核表达水平上,通过ELISA实验,证明GP5蛋白不与CD163各个片段相互作用,而当将GP5的几个抗原表位(GP5-1,GP5-2,GP5-3,Gp5-4)分段表达时,发现GP5-1与P1,P3和M1存在着一定的相互作用;GP5-2与P1,P3,M1有相互作用;GP5-4则与P1,M1;而GP5-3则与CD163各片段不存在相互作用。唾液酸粘附素Sn的分段蛋白Sn-1,Sn-3分别与CD163各个片段进行孵育,发现Sn-1与P1,M1,M3存在着相互作用,而Sn-3则与M1和M3有一定的相互作用。同时,还证明PRA与P3,M1相互作用,而PRB(非肌肉肌球蛋白ⅡB羧基端267AA处)则与P1,P2,P3和M1。